标本保存时间对HBV、HCV、HIV核酸检测的影响

标本保存时间对HBV、HCV、HIV核酸检测的影响

赖世平蔡华英

（自贡市中心血站；四川自贡643000）

【摘要】目的：探讨标本保存时间对实时荧光PCR检测HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA结果的影响。方法：将含高、中、低三种不同浓度HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA的血浆标本，2-8℃保存0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d时间后采用实时荧光PCR法，混检+单检模式进行HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA检测，对检测结果的Ct值进行比较分析。结果：在2-8℃条件下保存1-7d的血浆标本，其HBVDNA、HIVRNA、HCVRNA检测结果的Ct值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:2-8℃条件下保存7天内HBV、HCV、HIV核酸检测结果不受影响。

【关键词】保存时间、核酸检测、Ct值、影响

EffectofpreservationtimeonnucleicaciddetectionofHBV,HCVandHIV

CaiHuaying,LaiShiping

ZigongcentralbloodstationZigongcity643000

[Abstract]Objective:TheeffectofpreservationtimeontheresultsofHBVDNA,HCVRNAandHIVRNAdetectedbyreal-timefluorescencePCRwasinvestigated.Methods:Theplasmasamplescontaininghigh,mediumandlowconcentrationsofHBVNA,HCVRNAandHIVRNAwerepreservedat2-8℃for0,1,2,3,4,5,6,and7days.TheresultsofHBVNA,HCVRNAandHIVRNAweredetectedbyreal-timefluorescencePCR,andtheCTvaluesoftheresultswerecomparedandanalyzed.Results:TheCvalueofHBVDNA,HIVRNAandHCVRNAinplasmasamplesstoredat2-8Cfor1-7dayshadnosignificantdifference(P>0.05).Conclusion:thedetectionresultsofHBV,HCVandHIVnucleicacidswerenotaffectedduring7daysofstorageat2~8℃.

Keywords:preservationtime,nucleicaciddetection,Ctvalueandinfluence

[中图分类号]R2[文献标号]A[文章编号]2095-7165（2018）22-0015-02

为了降低输血致感染性疾病的发生，保证临床输血安全，献血者血液筛查自2015年起全国采供血机构在酶联免疫检测的基础上开展了核酸PCR扩增检测技术,该技术能让酶免疫检测方式的窗口期有效缩短，有效检出各种因素引起的漏检，让输血感染病毒的概率降低[1]。虽然..核酸检测（NAT）技术灵敏度高、特异性强，具有缩短检测窗口期的能力，但受标本影响因素多，保存、处理不当，会造成病毒核酸的降解，有可能引起假阴性，从而影响检测结果的准确性。由于不同实验室检测系统和试剂，管理模式不同，用于核酸检测的标本的关键控制点不同，本文就2-8℃条件下保存时间对HBV、HCV、HIV核酸检测的影响进行分析，现报道如下：

1、材料与方法

1.1标本的收集与处理

1.1.1阴性血浆的收集收集2018年1月1日—5月31日本站献血者乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）血清学和核酸检测均呈阴性的血浆。

1.1.2阳性血浆的收集分别采集上述时间段内HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA检测阳性的献血者血液5ml于含EDTA-K2的惰性分离胶管内，立即离心分离血浆。

1.1.3检测样本的制备将阳性血浆用血清学和核酸检测均呈阴性的血浆稀释制成含高、中、低三种不同浓度HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA标本。

1.2仪器和试剂

1.2.1仪器DA3000全自动核酸提取仪、AFD9600型核酸扩增仪、医用冷冻离心机、医用冷藏箱。

1.2.2试剂乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒（1型）核酸检测试剂盒（厂家：中山大学达安基因股份有限公司，批号：2017003，效期：20181119），血源性筛查HBV/HCV/HIV核酸血清液体质控品（厂家：广州邦德益生物科技有限公司，批号：2017003，效期：20190407）。

1.3方法将高、中、低三种不同浓度的HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA标本等分成8份放置于真空采血管中，2-8℃保存（各15份）。依次于0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d的同一时间取一份采用实时荧光PCR法在中山达安DA3000核酸检测系统上进行检测，检测模式为混检+单检。混检模式为7份经血清学和核酸检测均呈阴性的血浆标本与上述每一份阳性样本汇集为1份混合标本，在DA3000全自动核酸提取仪、AFD9600型核酸扩增仪上进行混样、提取、扩增：混样检测结果Ct值<40，表示该份标本阳性；混样检测结果Ct值>40，需对该份标本进行单检，单检检测结果Ct值<40表示该份标本阳性，单检检测结果Ct值>40表示该份标本未检出。

1.4统计学方法用SSPS软件对数据进行分析，组间比较采用方差分析，两组数据间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1HBVDNA2-8℃保存7天检测结果，结果见表1。

表12-8℃条件下不同保存时间HBVDNA检测结果Ct值

3讨论

3.1由于标本量及检测周期等原因，献血者血液筛查标本很难做到立即检测，短时间内一般都存放在2-8℃冰箱内待检。但由于靶核酸（尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要[2],特别是弱阳性标本，靶核酸浓度降解到检测系统灵敏度以下，会检测不出，影响检测结果。所以在日常检测工作中，我们必须要考虑保存时间对核酸检测的影响，以免靶核酸在2-8℃冰箱长时间保存过程中出现降解的风险。

3.2本文旨在研究2-8℃条件下不同保存时间对HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA核酸检测的影响。保存时间对于HCVRNA检测的影响，据报道[3]，在保存温度为4℃的条件下，保存72小时内，HCVRNA标本检测Ct值差异均无统计学意义，但在保存1-4周后，其检测Ct值明显增大。姚凤兰等[4]也发现9份HCVRNA弱阳性标本在4℃7d内，HCVRNA的含量没有出现显著变化，但在保存2d后标本的浓度开始下降。我们的结果显示7d内HCVRNA检测Ct值差异不大，无统计学意义，但随着保存时间的延长，检测Ct值有逐渐增大的趋势，提示HCVRNA在2-8℃保存过程中，浓度可能在下降。

3.2乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，主要的传播途径是血液传播，输入极少量有病毒的血液或血制品即可导致感染。用实时荧光PCR检测HBVDNA的众多影响因素中，样本储存因素占的比例较大，王婷婷等报道[5]，样本的储存因素在实时荧光ＰＣＲ对乙肝ＤＮＡ检测的影响因素中占38.1%的比例，因此样本储存条件直接影响到HBVDNA的稳定性。对于HBVDNA的稳定性，马岩报道[6]标本在4℃和室温下保存7天内，HBVDNA的稳定性不受时间和温度的影响,庄养林等报道[7]，在4℃及25℃温度保存4h至4周，HBVDNA检测循环阈值（Ct值）差异均无统计学意义。本研究显示，标本在2-8℃保存7d内HBVDNA检测结果差异无统计学意义，因此，HBVDNA在短时间内是比较稳定的，在2-8℃保存7d内检测结果不受影响。

3.3艾滋病毒属RNA病毒，对于RNA测定，标本的保存方式对测定结果，可能有决定性影响[1]。据报道纯化后的HIVRNA在2-8℃保存条件下至少可以保存7d[8],对于未纯化的HIVRNA，庄养林等报道在25℃及以下温度保存4h至4周，HIVRNA检测循环阈值（Ct值）差异均无统计学意义[7]。本文只对纯化前标本的储存做了研究，结果显示标本在2-8℃保存7d内HIVRNA检测结果差异无统计学意义，与国外报道[9[10]]HIV-1比较稳定的结论一致。因此，HIVRNA保存在2-8℃条件下7d内，检测结果不受影响。

3.4从表4还可以看出，HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA在2-8℃保存过程中，不论浓度的高低，其变化是一致的。因此，标本保存条件对核酸检测结果的影响不受标本浓度的影响。

从上面的结论可以看出，献血者血液筛查标本中HBVDNA、HIVRNA、HCVRNA在2-8℃保存7d内检测，其检测Ct值均无统计学意义。

但HCVRNA检测Ct值有逐渐增大的趋势，在考虑检测时限时应综合考虑三种病毒的稳定性,因为采供血机构核酸实验室的标本几乎都是酶免检测阴性，是为了尽可能检测出病毒窗口期的标本，其浓度很低，如果保存时间过久，核酸降解，有可能检测不出，从而导致含有病毒的血液进入临床，引起输血感染。

4、参考文献：

[1]彭小华，李丽平，欧阳刚，等．核酸检测技术在血液筛查中的应用研究［J］.中国输血杂志，2015，28(6):717-720

[2]李金明，实时荧光PCR技术[M].人民军医出版社.2015:65

[3]庄养林，熊丽红等，标本因素及保存条件对HCVRNA检测的影响[J].实验与检验医学2017，35（2）：228-230

[4]姚凤兰，陈瑜等，标本保存温度、时间和不同采血管对核酸检测结果的影响[J].中国输血杂志，2012，25（06）：530-533

[5]王婷婷等，实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J].中国保健营养，2013,12：7473-7473

[6]马岩，姚继莹，标本保存时间、温度对荧光定量HBVDNA检测的影响[J].国际免疫学杂志，2016，39（2）：149-151

[7]庄养林等，溶血、脂肪血及保存条件对HBVDNA、HIVRNA核酸检测的影响[J].天津医药，2017,45（10）：1025-1028

[8]王倩等，纯化后的HCVRNA、HIVRNA在2-8℃保存条件下的稳定性研究[J].世界最新医学信息文摘，2017,89:261-262

[9]MeiniG，MaterazziA,SaladiniF，etal.StabilityofunfrozenwholebloodDNAforremotegenotypicanalysisofHIV-1coreceptor

tropism［J］.BMCInfectiousDiseases，2013，13（1）：508-512.Doi:10.1186/1471-2334-13-508.

[10]AitkenSC，WallisCL，StevensW，etal.StabilityofHIV-1nucleicacidsindriedbloodspotsamplesforHIV-1drugresistancegenotyping［J］.PLoSOne，2015，10（7）：e0131541.doi：10.1371/journal.pone.0131541.