复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响

复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响

姜家康陈睿

姜家康陈睿(通讯作者)迟文成（黑龙江中医药大学附属第一医院150040）

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）24-0067-03

【摘要】目的复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠的抑制作用及其可能机制。方法建立H22原发性肝癌小鼠模型，随机分为空白对照组、荷瘤对照组、化疗组、中药低、中、高剂量（4.48、8.96、17.92g/kg·d）组进行治疗，检测各组肿瘤的生长情况；HE染色观察肿瘤组织和肝组织的病理变化；免疫组化法检测肿瘤组织MMP-9的表达。结果与荷瘤对照组比较，复原抗癌汤各剂量以及顺铂对原发性肝癌均有抑制作用，抑瘤率分别为53.12%、32.87%、37.51%、39.82%（P均＜0.05）；HE染色见化疗组、中药治疗组癌组织较荷瘤组生长局限，核仁固缩，核浆比较对照组小，形态较规则，核仁边移现象少见；免疫组化见中药治疗组与化疗组比较其MMP-9蛋白表达强阳性率高于后者（P＜0.05）。结论复原抗癌汤通过抑制MMP-9的生成，抑制基质降解，最终抑制肝癌细胞的血性转移。

【关键词】复原抗癌汤原发性肝癌mmP-9

原发性肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，素有“癌中之王”之称，早期症状隐匿，发现时已属中晚期，病死率高，这与其具有高度侵袭与转移关系密切。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1免疫组化试剂：即用型SABC免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒、小鼠用MMP-9蛋白免疫组化检测试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2实验仪器：主要包括：日本OLYMPUS公司超薄切片机、日本日立公司透射电子显微镜H－600、中国光学仪器厂倒置式生物显微镜XSJ-D。

1.1.3实验药品（1）复原抗癌汤：1.75g/装，江苏江阴天江药业特制提供。其主要成分如下：(西洋参、红豆杉、黄芪、白术、半枝莲、竹茹、薏苡仁、厚朴、柴胡、白花蛇舌草)复原抗癌汤由以上药味经特定的制备工艺和流程提纯制成。(2）顺铂（DDP）：20mg/支，山东齐鲁制药有限公司生产，批号：7050172DC。(3）生理盐水：500ml，哈尔滨制药六厂生产。

1.2方法

1.2.1动物分组选用BALB/C小鼠120只(雌雄各半)，体重18～20g，由哈尔滨医科大学肿瘤附属医院实验动物中心提供（合格证号：SCXK（黑）2006/008）。随机分组：A组（空白对照组）、B组（荷瘤对照组）、C组（化疗组）、D组（中药低剂量对照组）、E组（中药中剂量对照组）、F组（中药高剂量对照组）,每组10只。

1.2.2造模瘤株：H22原发性肝癌荷瘤小鼠购自长春生物试剂动物实验中心。将H22原发性肝癌荷瘤小鼠[1]后脱颈处死，在超净工作台上分离瘤体，将实体瘤部分放入75％酒精浸泡消毒10min后，取生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水洗净后剪碎加生理盐水研磨，过300目尼龙网制成单细胞悬液，台盼蓝（tryan-blue）染色试验计算后细胞数>95%，用吸管轻吹打待测细胞悬液，取少许在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，按白细胞计数法，于低倍镜下计数4角的4个大方格内活细胞总数，按下式计算：

用生理盐水调整细胞浓度至1×107/ml，取1ml注射器吸取0.2mL瘤细胞悬液，按照下述方法接种于B组、C组、D组、E组、F组BALB/C小鼠肝左叶内，制成原位原发性肝癌模型[2]。

1.2.3给药A组：予0.2ml/d生理盐水灌胃，每日一次；B组：予0.2ml/d生理盐水灌胃，每日一次；C组：予顺铂3mg/kg·d，每只0.3ml腹腔注射，隔日一次，共7次；D组：予复原抗癌汤按4.48g/kg·d药量灌胃，每次0.2ml，每日一次；E组：予复原抗癌汤按8.96g/kg·d药量灌胃，每次0.2ml，每日一次；F组：予复原抗癌汤按17.92g/kg·d药量灌胃，每次0.2ml，每日一次。各组于接种日起第3天开始给药，按上述方式给药达到治疗次数后停药，并于次日进行实验动物取材。

1.2.4取材停药次日，颈椎脱位法处死小鼠，打开腹腔，暴露肝组织及肿瘤组织，无菌摘取瘤体，电子天平称取瘤重，依次做标记，随后以中性福尔马林固定12小时，备用。

1.3观察指标

1.3.1通过计算抑瘤率来观测复原抗癌汤对肿瘤生长的抑制作用

停药次日，颈椎脱位法处死小鼠，打开胸腔，暴露肝组织及肿瘤组织，无菌摘取瘤体，电子天平称取瘤重，依次做标记，按公式[3]:

抑瘤率=*100%

计算抑瘤率。

1.3.2观察小鼠肿瘤组织及肝组织形态学改变

将已固定的肿瘤组织及肝组织取出；逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，6μm厚切片；HE染色，中性树脂胶封片，观察并比较各组小鼠肝组织和肿瘤组织的形态学有无变化。

1.3.3免疫组化法检测肿瘤组织的MMP-9蛋白表达

免疫组化法检测原发性肝癌组织中MMP-9蛋白的表达，参考试剂盒说明书。

判断标准：经免疫组化法各步骤处理后MMP-9阳性细胞的胞浆和/或胞核呈淡黄色或棕黄色，采用二级计分法进行阳性细胞计数[4]，高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，计算每张切片阳性细胞百分率，阳性细胞数＜5%，0分;5%～25%，1分;25%～50%，2分;50%～75%，3分;＞75%，4分。染色强度:淡黄色1分;棕黄色2分;棕褐色3分;两者相加:0～1分为阴性(－);2～3分为弱阳性(+);4～5分为中度阳性(++);6～7分为强阳性(+++)。

1.4统计方法

本研究所有数据采用SPSS统计软件进行处理，H22原发性肝癌小鼠瘤重的组间比较采用单因素方差分析，数据以x-±s表示，P<0.05有统计学意义。肿瘤组织MMP-9蛋白表达的组间比较采用X2检验。以P<0.05作为有统计学意义，以P<0.01作为有显著差异。

2结果

2.1复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠局部肿瘤生长的影响（见表1）

表1复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠局部肿瘤生长的影响

注：*与B模型组比较p<0.05

从表1中数据可以看出，C组、D组、E组、F组的瘤重明显低于B组的瘤体重量。经组间t检验示，D、E、F组、C组均有明显的肿瘤生长抑制（P＜0.05）,其中，C组的对肿瘤的抑制作用要高于D组、E组和F组。

2.2复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠肿瘤及肝组织形态学变化的影响

H22原发性肝癌小鼠局部肿瘤，对照组癌组织未用药细胞具有癌细胞的一般特征，核大，常有内折，核浆比大，有多个大核仁，形态不规则，电子密度不均，常见核仁边移现象。染色质比较可见常染色质多而异染色质少，细胞浆基质密度均匀，细胞内无退变的细胞器，细胞表面微绒毛细长且密集。治疗组癌组织较局限,核仁固缩，核浆比较对照组小，形态较规则，核仁边移现象少见。(见图一）

2.3复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠肿瘤及肝组织MMP-9mRNA及蛋白表达的影响

使用免疫组化法检测瘤体MMP-9蛋白表达结果如表3所示。从表2中数据可以看出，D、E、F组、C组H22肝癌组织MMP-9蛋白的强阳性率均低于B组（P＜0.05）,D、E、F组与C组相比MMP-9蛋白的强阳性率较高（P＜0.05）,F组MMP-9蛋白强阳性率与D组相比较高（P＜0.05）,与E组相比无统计学意义（P＞0.05）。

表2复原抗癌汤对肿瘤组织MMP-9蛋白表达的影响（X2）

注：*为与B组比较P＜0.05#为与C组比较，P＜0.05

△为与D组比较P＜0.05●为与E组比较P＞0.05

3讨论

肿瘤是多途径多环节多基因异常所致疾病，有资料显示，癌组织中MMP-9基因呈显著高表达，表明MMP-9可通过破坏局部组织结构和基膜屏障，促进肿瘤新生血管的形成和肿瘤生长，有利于肿瘤细胞发生侵袭和转移[5]。

复原抗癌汤以益气养阴，清热解毒，散积消徵，扶正固本为法组方，是姜家康教授在总结前人治疗肝癌有效方剂的基础上，依据中医药辩证理论，结合临床而形成的有效复方。本研究证实复原抗癌汤通过对MMP-9蛋白的影响，细胞因子水平阐述了本药能够抑制肿瘤生长与转移，同时，根据多年的随访和治疗表明，该复方不仅可以明显改善患者的机体免疫力，而且可以减轻疾病给患者带来的痛苦，改善患者生存质量，提高患者的生存率。

参考文献

[1]蔚林兰,冯明辉,杜发斌,黄崇政.水律汤对H22肝癌腹水小鼠生存期及体重的影响[J].中西医结合肝病杂志,2010,20(2):100-101.

[2]王金烁.健脾丸抗肝癌作用及其作用机制的实验研究[D].石家庄:河北医科大学.2007

[3]黄智芬,黎汉忠,施智严,等.健脾消积口服液结合西药治疗Ⅱ、Ⅲ期肝癌40例临床观察[J].中国中西医结合杂志,200323(3):193.

[4]LuCD，AltieriDC，TanigawaN.Expressionofanovelantiapoptosisgene，surviving，correlatedwithtumorcellapoptosisandP53accumulationingastriccarcinoma[J].CancerRes，1998，58(9):1808－1812.

[5]蒋扬富,杨治华,胡敬群,等.血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9在原发性肝癌中的表达及其临床意义[J].癌症,2000,19(1):17.

本研究属黑龙江省科技攻关计划支撑研究，项目编号：2009G0940。