反相高效液相色谱法测定大鼠肝脏中视黄醇的含量

反相高效液相色谱法测定大鼠肝脏中视黄醇的含量

王珩瑜曾婧（通讯作者）黎关炼王黎李婉何璋

（武汉科技大学医学院公共卫生学院湖北武汉430065）

【摘要】目的：建立反相高效液相色谱测定大鼠肝脏中视黄醇含量的方法。方法：取肝脏样品，匀浆后加入乙醇和正己烷萃取，涡旋后离心，移取正己烷层氮气吹干，残渣用乙醇溶解进样。色谱条件：流动相：甲醇：水（90:10v/v），柱温：25℃，流速：1ml/min，检测波长：325nm。整个操作避光进行。结果：视黄醇浓度在浓度0～50ug/ml范围内呈线性，平均回收率为94.55%，全部操作可在20分钟内完成。36例大鼠肝脏视黄醇浓度范围为4.85～122.53μg/g，均数为37.61±5.13μg/g。结论：该方法简单、快速，准确性高，重现性好，适合大样本处理时使用。

【关键词】高效液相色谱；视黄醇；肝脏；大鼠

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）27-0392-03

维生素A是人体生长发育过程中不可缺少的营养物质之一，也是维持人体代谢和健康所必需的营养素之一，因此一直是医学研究的热点[1-2]。动物肝脏中维生素A含量较高，但目前对于动物肝脏维生素A的测定报道非常少。大鼠作为医学最常用的研究模型，实验中常常涉及要检测大鼠肝脏的维生素A浓度。本实验室在参考大量国内外文献并进行试验后，并采集了36份大鼠肝脏样品进行检测，现汇报如下。

1.材料与方法

1.1实验动物

健康雌性SD大鼠(SPF级)36只，20月龄，体重316.65±59.83g，由湖北省疾病控制与预防中心提供。饲养于具有动物饲养设施合格证的饲养室，室温(26±2)℃，自然光照，每笼5只，自由进食和饮水，每隔1～2天更换笼中垫料。

1.2实验仪器与试剂

主要仪器设备包括LC-3000高效液相色谱仪（山东鲁创分析仪器有限公司），UV3000型紫外检测器（北京创新通恒科技有限公司），C18柱（北京创新通恒科技有限公司,4.6x250mm,微粒大小为5um），平头液相微量进样器（上海高鸽工贸有限公司，50μL），恒温水浴锅（HH-8型），离心机（LD5-2A型），数据处理系统是CXTH-3000工作站系统。

视黄醇（all-trans-retinol）购于美国Sigma公司，所用流动相均为进口色谱纯试剂，其他试剂为国产色谱纯。

1.3肝脏样品采集及前处理

大鼠禁食不禁水12小时后，对大鼠进行劲椎脱臼处死，采用自制的简易固定器将大鼠竖直固定在铁架台上，对大鼠腹部进行快速酒精消毒后，取肝组织于5mlEP管，放入-80℃冰箱保存。

检测前，先称取100mg左右肝脏样品于匀浆器内，加入2mlPBS缓冲液充分研磨后，转移200ul匀浆液于试管内并加入100ul的乙醇（含有0.1mmol/L抗坏血酸），加入4ml正己烷，涡旋后常温离心（25℃，3000rpm，3min），移出正己烷层，37℃下氮气吹干，残渣用50μl乙醇溶解（含有0.1mmol/L抗坏血酸），然后取20μl进样。整个前处理过程注意避光，并在暗室进行。

1.4色谱条件

流动相：甲醇：水（90：10v/v），柱温：25℃，流速：1ml/min，检测波长：325nm。

2.结果

2.1校准曲线

取成倍比例稀释的标准系列应用液浓度在（0～50）ug/ml之间，按照上述色谱条件做高效液相色谱分析法（HPLC）测定，结果以以视黄醇的浓度为横坐标，视黄醇峰面积比上10000为纵坐标，做出校准曲线（图1）。回归方程为y=4.0961x+2.9123，R2=0.999.

图1视黄醇标准品校准曲线

2.2视黄醇样品及标准品HPLC图谱

如图2所示，在选定的色谱条件下，标准品和样品的峰形尖峭，无杂峰，视黄醇出峰时间为14.5min左右（见图2）。

图2视黄醇标准品（左图）和样品（右图）的HPLC图谱

2.3精密度实验

对同一标准溶液重复进样5次，以浓度的相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）考察精密度。如表1所示，本测量方法精密度良好，相对标准偏差平均值为2.46%。

表1精密度实验结果

2.6各组大鼠肝脏维生素A测定结果

使用高效液相色谱法一共测得36例大鼠肝脏中的维生素A水平，肝脏维生素A浓度在4.85～122.53μg/g，均数为37.61±5.13μg/g。

3.讨论

常用的测定维生素A的方法包括分光光度法，紫外分光光度法，荧光法，高效液相色谱法等，由于液相色谱仪的普及，高效液相色谱法成为越来越普遍的方法。简化了操作步骤，降低了成本，节约了时间，且可尽可能保证维生素A在操作过程中不被破坏，适合大样本时使用，能得到较好的回收率。本次测得肝脏维生素A浓度均数为37.61±5.13μg/g，和其他研究结果相一致[7]。

综上所述，该方法前处理步骤简单、快速、重现性好，回收率高，是检验动物肝脏维生素A的理想方法。

【参考文献】

[1]BlomhoffR,BlomhoffHK.Overviewofretinoidmetabolismandfunction[J].JNeurobiol.2006,66.

[2]FieldsAL,Retinoidsinbiologicalcontrolandcancer.JCellBiochem.2007,102:886-898.

[3]林情员.高效液相色谱法检测鱼肝中维生素A.福建分析测试.2009,18(2).

[4]姚碧霞等.几种动物肝脏中维生素A的含量分析.应用化工.2008,37(8).

[5]MajchrzakD,VitaminAcontent(retinolandretinylester)inliversofdifferentanimals[J].FoodChemistry,2006,98.

基金项目：武汉科技大学大学生科技创新基金（14ZRC166），湖北省大学生创新创业训练计划项目（201410488048）