miR-101对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡影响机制分析

miR-101对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡影响机制分析

司书静毛建广

高青县人民医院山东省淄博市256300

[摘要]目的探究miR-101对骨肉瘤MG-63细胞增殖率和凋亡率的影响。方法通过培养骨肉瘤细胞，合成阴性对照序列与miR-101模拟物序列，进行转染，设置空白对照组，采用MTT法检测各组细胞增殖率，采用流式细胞仪检测其凋亡率，记录结果并比较。结果转染率：miR-101模拟物转染组G0/G1期细胞百分比为（13.06±1.02）%明显高于阴性对照组（3.28±0.95）%与空白对照组（3.16±0.97）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞增殖：模拟物转染组在12h、24h、48h细胞增值率均低于阴性对照组与空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞凋亡：miR-101模拟物转染组细胞凋亡率为（11.30±1.43%）明显高于阴性对照组（3.14±0.76）%与空白对照组（3.03±0.94）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论miR-101能够下调骨肉瘤MG-63细胞的基因表达，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡。

[关键词]骨肉瘤；miR-101；细胞增殖与凋亡

骨肉瘤属于骨恶性肿瘤，好发于四肢长管状骨，其恶性程度较高，且容易向肺部转移，预后效果较差。临床研究发现，miR-101可调节肿瘤细胞的表达，抑制体内或体外肿瘤的生长，且miR-101包括上千种靶基因，通过负性调控这些靶基因的表达，能够调节与肿瘤发生、发展的信号通路，促进肿瘤细胞凋亡[1]。本研究旨在探讨miR-101对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料骨肉瘤MG-63与正常人成骨细胞由上海海尔顿公司购入，10%胎牛血清与RPMI-1640培养基购于美国Gilbco公司，miRNA检测试剂盒与PCR仪器购于上海生工生物工程股份有限公司，Trizol试剂与脂质体转染试剂购于美国英杰公司，兔抗人LC3与Beclinl抗体均购于英国Abcam公司，lgG羊抗兔购于美国Santa公司，上海索莱宝公司提供流式细胞检测仪及PI单染试剂与PI/AV双染试剂，美国BIOMOL公司提供MTT。

1.2方法①细胞培养与转染：将骨肉瘤MG-63置于含有10%胎牛血清的培养基中培养，温度设置37℃，CO2含量为5%，每隔2-3d换液一次，当细胞汇合度≥90%进行传代培养，合成阴性与miR-101模拟物转染组序列，取对数生长期接种于6孔板分别作为空白对照组、阴性对照组及miR-101模拟物转染组。以脂质转染体为载体，参照试剂盒步骤说明进行转染，24h于荧光显微镜下观察转染率。②提取细胞RNA，通过Trizol法提取转染后3组肿瘤细胞总RNA，采用紫外分光光度计测定纯度，并经琼脂糖电泳测定RNA的完整性，保存于-80℃。③细胞增殖检测：转染24h后将各组肿瘤细胞收集起来，接种于100μL孔板上，每个孔板约有细胞数1×104个，共计96个孔板，分别于6h、12h、24h、48h设3个复孔。当细胞贴壁后，每孔加入50μL的MTT，继续培养4h，取出上清液，每孔再注入150μL的二甲基亚砜震荡10min，波长为570nm测定其每孔光密度，计算细胞增殖情况，绘制曲线。③细胞凋亡检测：转染24h后收集肿瘤细胞，制成悬液，采用磷酸缓冲液冲洗2次，用70%乙醇溶液固定过夜，按照PI/AV双染试剂说明书进行双染，检测3组细胞凋亡率。

1.3评价指标比较3组间细胞增值率与细胞凋亡率。

1.4统计学方法采用SPSS20.0统计学软件，计量资料采用“±s”表示，组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

转染率：miR-101模拟物转染组G0/G1期细胞百分比为（13.06±1.02）%明显高于阴性对照组（3.28±0.95）%与空白对照组（3.16±0.97）%，差异有统计学意义（F=70.26，P＜0.05）；细胞增殖：模拟物转染组在12h、24h、48h细胞增值率均低于阴性对照组与空白对照组，差异有统计学意义（F=18.83、42.84、55.20，P＜0.05）；细胞凋亡：miR-101模拟物转染组细胞凋亡率为（11.30±1.43%）明显高于阴性对照组（3.14±0.76）%与空白对照组（3.03±0.94）%，差异有统计学意义（F=55.48，P＜0.05）。

3讨论

骨肉瘤是一种常见恶性肿瘤，因其具有较强的增殖、迁移、侵袭能力，采用手术与放化疗辅助治疗效果不佳，近年来临床上已引进基因疗法与靶向疗法治疗骨肉瘤，从分子水平研究肿瘤基因的表达，分子靶向治疗时对肿瘤细胞的特定基因片段、蛋白或基因产物，制定有效的靶向药物，干扰肿瘤相关基因与信号的转导，抑制肿瘤生长[2-3]。

本研究中，MTT增殖结果显示，miR-101模拟物转染组细胞增殖率低于阴性对照组与空白对照组，表明miR-101对骨肉瘤细胞具有一定的抑制作用；而流式细胞仪检测结果显示，miR-101模拟组细胞的凋亡率明显高于阴性对照组与空白对照组，表明miR-101可促进骨肉瘤细胞凋亡，影响其生长周期，从而达到治疗的目的。临床研究表明，miRNA可广泛调控细胞增殖、侵袭、转移、凋亡、自噬等细胞活动，通过miRNA种子序列与碱基配对的形式，与特定目标序列结合，影响肿瘤细胞mRNA的稳定性或抑制翻译过程，调节基因表达[4-5]。miR-101为miRNA重要家族成员之一，大量临床研究结果证实，其能够在多种肿瘤细胞中表达，影响细胞增殖与细胞凋亡，且自噬相关蛋白表达可影响肿瘤细胞的存活率，通过下调自噬可对肿瘤细胞增殖起到抑制作用[6]。

综上所述，miR-101可有效降低骨肉瘤MG-63细胞增殖率，加快肿瘤细胞凋亡，对骨肉瘤的治疗具有重要意义。

参考文献

[1]徐力立，周红光，司誉豪，等.miRNA抗肝癌机制与癌毒理论的关系研究概况[J].中医杂志，2017，58（8）：704-709.

[2]黄帅，郭慧慧，王璐璐，等.miRNAs与肿瘤[J].中国医药生物技术，2016，11（3）：267-271.

[3]林松，邵增务，范磊，等.微小RNA-101对人骨肉瘤细胞自噬和侵袭性的影响[J].肿瘤防治研究，2014，41（12）：1296-1299.

[4]王宝庆，陈玉军，姜建强，等.microRNA-101过表达对胶质瘤细胞U251抑制作用的实验研究[J].中华神经医学杂志，2017，16（9）：893-897.

[5]张伟，赵学辉，阮腊林，等.miRNA-130b在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响[J].肿瘤防治研究，2017，44（5）：334-339.

[6]张志强，杨艳荣，马海英，等.miRNA-101通过下调COX-2的表达影响肺癌细胞的生物学功能[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2015，22（5）：584-589.