右归饮含药血清对骨髓间充质干细胞成软骨分化的促进作用及其microRNA表达谱分析

右归饮含药血清对骨髓间充质干细胞成软骨分化的促进作用及其microRNA表达谱分析

张葆鑫王兴国郝廷

内蒙古医科大学第二附属医院创伤一科呼和浩特010000

【摘要】目的：本文对采用右归饮含药血清对大鼠骨髓间进行干细胞软骨粉化的充质效应展开分析，并且将进行软骨分化过程中的microRNA表达谱的变化予以记录，对采用右归饮含药血清进行骨髓间充质干细胞成软骨粉化的促进作用进行论证，探讨右归饮含药血清中的分子机制。方法：对大鼠进行BMSCS体外培养，慢病毒感染后48小时给予右归饮含药血清干预治疗，进行7天的培养之后，采用II型进行免疫组化染色、Realtimepcr方法进行狙击蛋白聚糖表达的检测[1]。采用microRNA芯片技术以及生物信息化的方法，对差异microRNA进行表达谱变化的分析，预测关键的microRNA以及靶基因、信号通路。结果：对于BMSCS稳定性进行表达，采用右归饮进行治疗和采用转染进行治疗的组的II型胶原免疫组化染色以及甲苯氨蓝染色，呈现出阳性，空载组染色后呈现隐形。转染组和右归饮组、空载组经过聚集蛋白聚糖的表达、II型胶原mRNA的比较之后，发现有2个microRNA出现爱你了显著的下调。信号通路MAPK信号通路、TRAF6基因等呗预测为关键靶基因、信号通路以及microRNA。结论：右归饮含药血清能够促进BMSCS成软骨分化，通过阻断MARK信号通路，右归饮发挥了重要的治疗作用。

【关键词】右归饮；骨髓间充质干细胞；microRNA

骨科临床常见疾病包括关节软骨损伤。该疾病的自我修复能力交叉，一旦发生损伤，会严重影响患者的生活质量，导致关节功能障碍，临床上对于软骨修复的药物，采用传统的软骨移植等外科手术的方法，无法完全将软骨结构等加以修复。而且会带给患者沉重的经济负担。因此，根据中医理论的肾藏精、精生髓、髓生骨的研究，采用右归饮治疗软骨缺陷，经过实践证明具有显著疗效。采用在大鼠骨髓间进行充质干细胞的软骨粉化效应microRNA芯片技术以及生物信息学方法，通过microRNA表达谱，论证了右归饮促进BMSCS软骨分化的分子机制[2。

1.材料与方法

1.1采用的SD大鼠均为2月龄雄性，共40只。制备含药血清，使用了10只4周龄的SD大鼠，分离了其骨髓间的充质干细胞。试剂采用的慢病毒基因，为美国公司生产，荧光定量试剂盒、反转录试剂盒、擦汗女子日本，percoll淋巴细胞分离也产自背景，兔抗鼠II型胶原单克隆抗体、羊抗兔二杭擦汗女子杭州。仪器包括了CO2孵育箱，倒置相差显微镜、荧光显微镜、核酸蛋白测定仪、生物芯片扫描仪等。

对于大鼠的BMSCS的分离，采用的方法是密度梯度离心法。对SD大鼠进行了颈椎脱臼处死后，进行股骨的抽取，将软组织等予以去除，使用DMEM培养液，将剪短骨骺端的髓腔进行清洗，收集到的冲洗液采用过滤器进行过滤，离心速度设定为1000r/min，重复进行细胞悬液的制作，加入体积为两倍的分离液上层，将中间的乳白色细胞层进行收集，得到了DMEM培养液，48小时候进行换液，每隔3天进行1次换液。

1.2Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色细胞爬片，滴加正常山羊血清封闭液，每个样本设聚集蛋白聚糖mRNA表达、病毒转染、Ⅱ型胶原、用4%多聚甲醛PBS洗3遍，48h后检测TGF-β1基因的mRNA表达，固定30min；PBS洗3遍，0.5%TritonX-100通透20min，PBS洗3遍；室温下30min；去除反应体系如下：SYBRgreen5μL，Primer（mix）10μmol/L1μl，ddH2O3μL，cDNA1μL。引物诱导干预7d后检测聚集蛋白聚糖mRNA表达、Ⅱ型胶原。

2.结果

2.1对BMSCS进行形态学观察，48小时后可以看到纤维样的贴壁生长，呈纺锤形或者三角形的分布。6天后，细胞呈现了集落生长，大部分为梭形状。

2.2在荧光显微镜下进行病毒传染后的BMSCS的绿色荧光表达以及TGF-B1mRNA的表达的观察，可以看到随着时间的退役，右归饮组的细胞荧光逐渐消失。

3.讨论

经过研究。关节软骨的特异分泌包含了聚集蛋白聚糖细胞、能够进行关节功能的调节。同时，BMSCS具有的多向分化潜能能够发挥出扩增的优势，具有生活活性高的优点。随着基因导入的方法的使用越来越广泛，通过采用右归饮含药血清进行干预的方法，结果显示右归饮组细胞的聚集蛋白聚糖和II型胶原表达呈现为阳性。

MICRORNA是一组小RNA分子，具有20-22个核苷酸组成的非编码蛋白。通过目标降解和转录抑制，最终形成了生物学功能广泛的基因表达，在骨细胞分化中能够发挥重要的作用[3]。

右归饮出自景岳全书，其包含了肉桂、山药、山茱萸、枸杞子等药材，符合关节炎患者肾阳虚的特点。经过实验采集到的数据也说明，右归饮组的microRNA的表达要高于其他组别，说明右归饮在软骨细胞分化上起到了很好的促进作用。实验研究证明，对右归饮进行加减，能够改善额修复退变部位的脱落、龟裂等，减少细胞的凋亡率。因此，右归饮具有促进BMSCS向软骨细胞分化的优势，今后研究的方向影视从生物信息学的角度强化对右归饮的具体疗效的研究力度[4]。

参考文献：

[1]陈祁青，金红婷，吴承亮等.右归饮含药血清对TGF－β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响[J].浙江中医药大学学报，2015，（4）：304-311.

[2]郭志杰.初探激素性股骨头坏死患者应用右归饮的临床分析[J].中国保健营养（上旬刊），2014，24（5）：2572-2573.

[3]陈祁青，金红婷，应俊等.右归饮含药血清对骨髓间充质干细胞成软骨分化的促进作用及其microRNA表达谱分析[C].//第六届全国中医药博士生学术论坛论文集.2015：1380-1386.

[4]钱晓伟，潘丹岷，谭湘陵等.中药血清对大鼠bMSCs体外成软骨分化中Col2a1和Acan表达的影响[J].时珍国医国药，2012，23（2）：340-343.D

作者简介：张葆鑫，男，1985.03，内蒙古人，内蒙古医科大学第二附属医院创伤一科，硕士学历，主治医师，研究方向：创伤

国家自然科学基金委员会资助项目，项目名称：右归饮对绝经后骨质疏松症骨髓间充质干细胞影响的分子机制实验研究，项目批准号：81460734

△通讯作者：王兴国