正交试验法优选壮腰膝四味药材组方提取工艺研究

正交试验法优选壮腰膝四味药材组方提取工艺研究

龚卫红1韩立炜1郑海云2赵希贤3

龚卫红1韩立炜1郑海云2赵希贤3（1.北京中医药大学中药学院制药系100102；2.中国中医科学院中医

药科技合作中心100700；3.北京市崇文区药品检验所100075）

【摘要】目的通过正交试验，优选处方的最佳提取工艺。方法采用水提取方式，以水为溶剂进行提取，选择加水倍数，提取时间，提取次数三个因素，每个因素设计三个水平，因素水平见表1，按照正交实验L9（34）表进行试验。以粗多糖作为标志性成分，选定最优提取工艺。结果因素相关性为RC>RA>RB，药材的提取次数(C)为主要因素，加水量(A)为次要因素。提取的最佳工艺条件为提取2次，加10倍量水，提取时间为1.5h。结论优选得到的提取工艺简单、稳定、可行。

骨碎补具有补肾强骨、养伤止痛之功效。用于肾虚腰痛、耳鸣耳聋、牙齿松动、跌扑闪挫、筋骨伤折等症。淫羊藿，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效。怀牛膝，具有活血祛瘀、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行功效。枸杞有清肺、明目、滋肝、补肾之功效。延胡索具有活血化疲，行气止痛功效。[1]五味配伍组方则有补肾，壮腰膝，强筋骨止痛之功效。怀牛膝和枸杞含大量多糖，为了保证制剂质量，用正交设计法研究其最佳提取工艺，分析加水倍数，提取时间，提取次数对粗多糖得率的影响，优选出以粗多糖为标准的最佳提取条件。

1仪器和材料

1.1仪器

①uv-2800H型紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）。

②800电动离心机（金坛市医疗仪器厂）。

③数显恒温水浴锅HH-4（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。

1.2材料所有药材均购于北京本草方源药业有限公司。

1.3试剂

1.3.1乙醇溶液（80％）：20ml水中加入无水乙醇80ml混匀。

1.3.2氢氧化钠溶液（100g/L）：称取100g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。

1.3.3铜储备液：称取3.0gCuSO4·5H2O，30.0g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至1L，混匀、备用。

1.3.4铜试剂溶液：取铜储备液50ml，加水50ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。

1.3.5洗涤剂：取水50ml，加入10ml铜试剂溶液，10ml氢氧化钠溶液，混匀。

1.3.6硫酸溶液（100ml/L）：取100ml浓硫酸加入到800ml左右水中，混匀，冷却后稀释至1L。

1.3.7苯酚溶液（50g/L）：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100ml，混匀。

1.3.8葡萄糖对照品溶液：取在105℃干燥至恒重的D－无水葡萄糖对照品，批号110833-200904（供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所）适量，精密称定，加水制成每1ml含D－无水葡萄糖0.2mg的溶液。

2方法和结果

2.1样品的制备按处方投料，加规定量的水，煎煮规定的时间和次数，滤过，滤液浓缩至稠膏，放入真空干燥箱，干燥得干膏作为样品，进行测定。

2.2正交试验设计，选用L9(34)正交试验，结合影响该药材提取效率的主要因素，考察药材加水量、提取时间、提取次数对多糖含量的影响，同时考虑生产实际，选取3个水平，见表1。

表1试验因素水平

2.3方法

2.3.1标准曲线制备

精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入50g/L苯酚溶液1.0ml，混匀，小心加入浓硫酸10.0ml，混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.2试样处理

2.3.2.1样品提取

取本品，研细，取约1g，精密称定，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后补加水至刻度，混匀，过滤，弃去初滤液，续滤液备用。

2.3.2.2沉淀粗多糖

精密吸取续滤液50ml，水浴蒸干，以水5.0ml溶解，置于50ml离心管中，加入无水乙醇20ml，混匀后以3000r/min离心10min，弃去上清液。残渣用80％乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复3次操作。残渣供沉淀葡聚糖。

2.3.2.3沉淀葡聚糖

取上项下残渣，用水2.0ml溶解并转移至20ml离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0ml，铜试剂溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2min，冷却后以3000r/min离心10min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复3次操作后，残渣用100ml/L硫酸溶液2.0ml溶解并转移至5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。此溶液为样品测定液。

2.3.3样品测定

精密吸取样品测定液2.0ml置于25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0ml，混匀，小心加入浓硫酸10.0ml，小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却至室温后用分光光度计在485nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡萄糖质量，计算样品中粗多糖的含量。同时作样品空白试验。

X=（W1-W2）/（M×V2×V4/V1/V3)。

式中X-样品中粗多糖含量（以葡萄糖计），mg/g。

W1－样品测定液中葡萄糖的质量，mg。

W2－样品空白液中葡萄糖的质量，mg。M－样品质量，g。

V1－样品提取液总体积，ml。

V2－沉淀粗多糖所用样品提取液体积，ml。

V3－样品测定液总体积，ml。

V4－测定用样品测定液体。

3结果

见表2。

表2正交表及统计分析

4结果分析

影响因素大小顺序为C>A>B，即提取次数为最重要2次，其次为加水量10倍，提取时间差异不显著，选择1.5小时。提取条件选择A3B2C2。

5讨论

5.1为了全面反映提取效果，本处方采用分别测量总黄酮[5]和总多糖为标准初步筛选提取工艺，最终再结合增大投料量的生产实际数据确定最佳工艺，最大限度满足提取完全的要求。

5.2相比较以处方中各味药材单一有效成分为标准品，分别用高效液相色谱法测定含量后，综合考虑进行筛选工艺的方法；以总成分含量检测，方法简单，能反映整体提取程度，个人认为可以作为保健品和中药传统剂型的首选方法。

参考文献

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版:2000.

[2]赵文萍,仝瑛.苯酚-硫酸法测定梦舒胶囊中粗多糖含量[J].陕西中医,2009,3(6):725.

[3]刘长建,姜波,刘亮等枸杞子多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究[J].时珍国医国药,2009,20(3):661.

[4]刘友平,李祖伦.分光光度法测定川牛膝中多糖含量[J].成都中医药大学学报,1997,20(4):49-51.

[5]龚卫红,韩立炜,郑海云.赵希贤正交试验法优选壮腰膝五味药材组方提取工艺研究[J].中国健康月刊,2011,5:15.