食品中β-溶血性链球菌分离培养基及培养条件的应用研究

食品中β-溶血性链球菌分离培养基及培养条件的应用研究

吴福平1王毅谦1张洪元1邵景东1祝长青2

吴福平1王毅谦1张洪元1邵景东1祝长青2

(1.张家港出入境检验检疫局215600；2.江苏出入境检验检疫局210002)

【摘要】目的通过食品中β-溶血性链球菌的生物学特性及营养需求研究，选择更为适宜的分离培养基及培养环境，提高食品中β-溶血性链球菌的检出率。方法增菌后，利用哥伦比亚CNA血琼脂进行平板分离，置于36±1℃厌氧培养，后经常规生化及API20STREP试剂盒对分离菌鉴定。结果试验结果显示，哥伦比亚CNA琼脂可有效地抑制G-杆菌的生长，降低杂菌对目标菌的干扰；36±1℃厌氧环境使目标菌形态、溶血性状况更为典型，更利于β-溶血性链球菌的分离和筛选，提高检出率。结论哥伦比亚CNA血琼脂分离及36±1℃厌氧培养可有效地提高食品中β-溶血性链球菌检出。

【关键词】β-溶血性链球菌；哥伦比亚CNA血琼脂；厌氧培养；检出率Applicationofisolationmediumandcultureconditionsindetectionofβ-hemolyticStreptococcusinFood.

WUFu—ping1WANGYi—qian1SHAOJing—dong1ZHUChang—qing2

1.Zhangjiagangentry-exitinsectionandquarantinebureau,Zhangjiagang215600China;2.Jiangsuentry-exitinsectionandquarantinebureau,Nanjing210002China.

[Abstract]ObjectiveChooseamoresuitableisolationmediumandtrainingenvironmenttoincreasedetectableratethroughresearchingthebiologicalcharacteristicsandnutritionalneedsofβ-hemolyticstreptococcusinFood.MethodsAfterenrichment,UsingColumbiaCNAseparation,anaerobiccultivatingat36±1℃,thenidentifingbyconventionalbiochemicalandAPI20STREP.

ResultsTestshowed,ColumbiaCNAcaneffectivelyrestrainthegrowthofG-bacteria,reducetheinterferencetotargetbacteria.After36±1℃anaerobiccultivating,thetargetbacteria’sformandhemllyticsituationbecomemoretypical,andfavorsseparationandscreeningtheβ-hemolyticStreptococcus,improvingdetectablerate.ConclusionUsingColumbiaCNAand36±1℃anaerobictrainingcaneffectivelyimprovedetectablerateofβ-hemolyticstreptococcusinFood.[Keywords]β-hemolyticStreptococcus;ColumbiaCAN;Anaerobictraining;Detectablerate

链球菌属中与食品卫生和安全有关的链球菌主要是β-溶血性链球菌，尤以A群链球菌（如化脓链球菌）和B群链球菌（如无乳链球菌）为主[1，2]。β-溶血性链球菌对人的毒力较强，能够引起各种化脓性疾病、肺炎、伤口感染和败血症等。β-溶血性链球菌大多为兼性厌氧菌，少数为厌氧菌。最适生长温度为37℃，PH7.4～7.6。营养要求较高，在普通培养基中生长不良，需添加血液、血清、葡萄糖等[3]。目前GB/T4789.11-2003溶血性链球菌的检验中主要使用血平板常规培养进行分离，杂菌对目标菌的干扰较大，本研究拟利用哥伦比亚CNA血琼脂平板及36±1℃厌氧培养进行菌落分离，提高检出率。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株

化脓链球菌ATCC12384、ATCC49399、无乳链球菌ATCC12386、ATCC13813、大肠杆菌ATCC8739、沙门氏菌ATCC13311、志贺氏菌ATCC12022、金黄色葡萄球菌ATCC12600、单核细胞增生李斯特杆菌ATCC10801。

1.1.2培养基及主要试剂葡萄糖肉浸液肉汤、血琼脂、哥伦比亚CNA琼脂、草酸钾人血浆、0.25%氯化钙、API20STREP试剂盒。

1.1.3实验设备培养箱、厌氧罐、拍打器。

1.1.4供试样品鸡肉20批、生猪肉30批、生牛奶30批。

1.2方法

1.2.1哥伦比亚CNA血平板生长试验将培养过夜的化脓链球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特杆菌分别接种哥伦比亚CNA血平板，36±1℃培养24h，观察平板菌落形态；

1.2.2哥伦比亚CNA血平板需厌氧培养效果比较将培养过夜的化脓链球菌、无乳链球菌菌液1：10倍比稀释，吸取0.1ml于哥伦比亚CNA血平板涂布，置于36±1℃厌氧、需氧培养24h，计数。

1.2.3样品的检测将供试样品按GB/T4789.11-2003及改良的方法同时进行检测。

2结果

2.1各实验菌株哥伦比亚CNA血平板生长情况

2.2哥伦比亚CNA血平板在需厌氧环境下平板菌落数

2.3样品阳性检测结果

3讨论

哥伦比亚CNA琼脂与普通血琼脂相比，在成分配比上增加了10%多粘菌素及10%萘啶酮酸[4]，其余成分接近。从各实验菌株在哥伦比亚CNA血平板生长的情况来看，沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌等G-杆菌在平板上均未生长，说明该培养基所含10%多粘菌素及萘啶酮酸有效抑制了G-杆菌的生长；化脓链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌等G+菌则在平板上生长良好。哥伦比亚CNA琼脂可有效抑制G-杆菌的生长，从而降低了对目标菌生长的干扰，有利于对目标菌的筛选分离。

对4株倍比浓度化脓链球菌、无乳链球菌菌液厌氧、需氧环境培养计数，发现同浓度的菌液厌氧培养菌落数明显多于常氧培养，其菌落形态表现更为典型。表现为菌落直径变大，溶血性增强，同时，厌氧培养对非目标菌有一些明显的抑制作用，例如金黄色葡萄球菌，在哥伦比亚CNA平板需氧培养中呈现为灰白色菌落，β溶血，与目标菌形态相似，还需生化鉴定加以区分，但在厌氧环境下，金黄色葡萄球菌菌体明显减小，24h培养呈针尖状，与目标菌可明显区分，有效提高了辨别率。同时该方法还可抑制其他需氧菌的生长，有利于β-溶血性链球菌的筛选分离，提高检出率。通过对80份供试样品的检测，使用生化方法及API20STREP鉴定，GB/T4789.11共检出化脓链球菌5例、无乳链球菌3例，哥伦比亚CNA血平板厌氧培养方法共检出化脓链球菌6例、无乳链球菌5例，检出率提高。

综上所述，哥伦比亚CNA血平板分离及厌氧培养更有利于β-溶血性链球菌的筛选分离，降低对目标菌生长干扰，有效提高检出率。

参考文献

[1]纪铁鹏.主编.乳品微生物学[M],2006年,中国轻工业出版社.陆承平主编.

[2]雷质文.主编.肉与肉制品微生物监测应用手册[M],2008年,中国标准出版社.

[3]兽医微生物学（第四版）[M].15章,2007,中国农业出版社.

[4]陈冠容.多粘菌素临床应用进展及应对超级细菌[J].医药导报,2011,30(2):135-140.