高效液相色谱法测定人血浆中奋乃静的浓度

高效液相色谱法测定人血浆中奋乃静的浓度

陈清霞王丽霞刘伟忠

陈清霞王丽霞刘伟忠（中山大学附属第二医院药学部广东广州510120）

【摘要】目的建立测定人血浆中奋乃静浓度的反相高效液相色谱法。方法以钻石C18反相柱(150mm×4.6mm,5µm)为色谱柱，流动相为0.03mol•L-1醋酸铵-甲醇（23:77）；流速：1.0ml•min-1；柱温：40°C;检测波长:254nm。以乙酸乙酯与二氯甲烷(80:20)为提取剂。结果奋乃静的高、中、低（1000.0,500.0，10.0µg.L-1）3种浓度平均回收率分别为104.28%,97.60%，98.40%，日内、日间差RSD均低于7%（n=5）;分析方法的检测限为5.0µg•L-1；线性范围为10.0-1000.0µg•L-1。回归方程为:C=39.42F+2.56，r=0.9995（n=10）。结论该方法灵敏、准确、简单、快速，可用于临床血药浓度监测和药动学研究。

【关键词】奋乃静血药浓度反相高效液相色谱法

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）25-0038-02

DeterminationoftheconcentrationofperphenazineinplasmabyRP-HPLCwithUVdetection

CHENQing-xiaWangli-xiaLIUWei-zhong(Departmentofpharmic,TheSecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.)

【ABSTRACT】ObjectiveToestablishamethodfordeterminingtheplasmaconcentrationofperphenazinebyRP-HPLCMethodsBloodplasmasamplescontainingthedrugwereextractedwithhexanefortheremovaloflipidsandotherinterferingsubstancesandthereafterextractedwithethylacetate.TheextractwasthenanalyzedinareversephaseHPLCsystem(C18column,150mm×4.6mm,5µm);mobilephaseconsistedof0.03mol•L-1NH4AC-methanol(23:77);Thedetectionwavelengthwasat254nm.ResultsTheaveragerecoveriesofperphenazineinhigh,mediunandlowconcentrations(1000.0,500.0,10µg•L-1)were104.28%,97.60%and98.40%,respectively.Thewithin-dayandbetween-dayprecisionofvariationwaslessthan6%.Thecalibrationcurvesofperphenazinehadgoodlinearity,r=0.9995（n=10）,overtherangeof10.0-1000.0µg•L-1.TheregressionequationwasC=39.42F+2.56,r=0.9996(n=9).Theminumumdetectableconcentrationofperphenazinewas5.0µg•L-1.ConclusionThemethodprovidesasensitive,accuratepreciseandreliableanalyticalprocedureforclinicalmonitoringofperphenazineinplasmaanditspharmacokineticsstudies.

【KEYWORDS】PerphenazinePlasmaconcentrationHPLC

奋乃静(perphenazine，Phz)其化学名为：4-[3-(2-氯吩噻嗪-10亚基)丙基]-1-哌嗪乙醇。是传统经典的抗精神病药[1]。虽然其药理作用尚未完全清楚，但普遍认为Phz的作用机制主要与其阻断中脑边缘系统及中脑皮层通路的多巴胺受体(DA1)有关[1]。研究表明，Phz属高副反应发生率药物，剂量越大血浓度越高，副反应越重，而临床疗效并不提高[2]。因此，对Phz进行血药浓度监测，寻找疗效最佳、副反应最轻的适宜血药浓度，具有一定的临床意义。Phz的血药浓度检测方法国内未见报道，国外有采用HPLC/FAB-MS检测法[3],但此法成本高,不便普及。也有采用HPLC法[4-5]，血浆药物提取可采用固液萃取，但操作烦琐。为方便对Phz血浓度的检测和药代动力学的研究。本实验建立了一种用乙酸乙酯与二氯甲烷(80:20)作为提取溶剂的简单、快速测定人血浆中Phz的浓度的高效液相色谱法。

1仪器和材料

1.1仪器高效液相色谱仪（Agilent1100），包括二极管阵列紫外检测器（DAD）G1315B、G1313A自动进样器、G1311自动调配、G1316A可调柱温恒温箱和Agilent色谱化学工作站；旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；电子分析天平（瑞士SARTORIUS）；高速离心机（美国MICRO1224）；真空干燥箱（德国MMM-GROUP）；超纯水仪(法国MILLIPORE)。

1.2药品和试剂Phz对照品（广州省药检所提供，含量>99%）。内标物为阿米替林（Sigma公司，含量>98%）。乙腈和甲醇(美国迪马公司)为色谱级，醋酸铵（广东台山粤侨试剂有限公司，含量>98%），乙酸乙酯与二氯甲烷（广州化学试剂厂，含量>99%），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3对照品和内标溶液精密称取Phz10.0mg加甲醇溶解并定容至10.0mL，置冰箱4℃保存。此为工作母液,临用时用甲醇稀释成所需浓度的Phz对照品溶液。配制浓度为2mg•L-1阿米替林甲醇溶液作为工作内标液。

2方法和结果

2.1色谱条件色谱柱：美国迪马公司的C18钻石色谱柱（150mm×4.6mm,5µm）；流动相：0.03mol•L-1醋酸铵-甲醇（23:77）；流速：1.0ml•min-1；柱温：40℃;检测波长:254nm；AUFS为0.01。

2.2样品处理方法1.0mL含药血浆加至10mL锥形离心管中，精确加入2mg•L-1内标液40μL,快速振荡数秒。再加入乙酸乙酯与二氯甲烷(80:20)4.0mL，密塞，旋转振荡2min，于4000r•min-1的离心机内离心4min。吸取上清液放入5ml锥形离心管内，50℃真空干燥至干。进样前加入100µL甲醇快速振荡数秒溶解残渣，吸取20µL进样。

2.3标准曲线的制备在10个10ｍL具塞锥形离心管中分别加入不同浓度、相同体积的Phz对照品溶液，各加空白血浆1.0mL，使血浆药物浓度分别相当于0，5.0，10.0,50.0，100.0，200.0，400.0，600.0，800.0，1000.0µg•L-1。然后按“2.2”项处理后。经HPLC分析，测得Phz峰面积与内标峰面积之比（F）作横坐标，以血浆Phz浓度（C）为纵坐标，得到10.0-1000.0µg•L-1范围的Phz血浆浓度标准曲线。直线方程为：C=39.42F+2.56,r=0.9996。当信躁比S/n=3时，Phz的检测限为5.0µg•L-1。阿米替林和Phz的保留时间分别为6.637min和8.922min，HPLC

图谱见图1。

ABC

图1Phz的高效液相色谱图

A:空白血浆；B：空白血浆＋Phz对照品＋阿米替林；C：患者服药后的血浆＋阿米替林；1-阿米替林；2-Phz

2.4方法学的专属性从图1可知，在本实验条件下，Phz和内标物的色谱峰能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。可见此方法具有较高的专属性。

2.5回收率及精密度实验取Phz低、中、高浓度（10.0,400.0,1000.0µg•L-1），制作提取前和提取后的两组样品，经色谱分析，以峰面积比较，得到的相对提取回收率均大于90%。同时在1d内重复5次和分散于2wk内重复5次测定其浓度，计算日内、日间误差及相对回收率。结果见表1。

表1相对回收率与日内、日间精密度（n=5）

2.6样品室温、冻存和长期稳定性的实验按“标准曲线制备”方法分别配制低、中、高浓度（10.0,400.0,1000.0µg•L-1）的3组18个样品（双样），分别在室温（25～28℃）放置4h和-20℃冻存24h以及-20℃冻存1、3wk后分别进行色谱测定，未见冻存样品的药物降解。

2.7样品的质量控制实验按“标准曲线制备”方法分别配制低、中、高浓度（10.0,400.0,1000.0µg•L-1）36个血浆样品（一式12份）置-20°C冻存备用，此即为质控样品。每次检测血样时同时检测质控样品，如果相对回收率均落在85%-115%之内，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。

2.8临床应用3例男性住院患者,年龄分别为31、35、42岁,口服Phz片分别24、32、36mg•d-1(广东彼迪药业股份有限公司,批号:20051201)。2wk后早上服药前采血检测其血药浓度为78.54、125.32、172.47µg•L-1。

3讨论

因Phz结构中有二个苯环，故有明显的紫外吸收。本实验在190-400nm的波长范围内进行紫外扫描，发现在219，254nm处均有一最大吸收峰,为减少溶剂峰和其它杂质的干扰，选择254nm为检测波长。本实验采用HPLC方法，具有操作简单、成本低、精密度和回收率高等特点，适用于化学药物分析和临床药代动力学研究，结果可靠。

在本实验的过程中，曾用0.03mol•L-1磷酸二氢钾（调PH6.4）和甲醇（25：75）做流动相，也能使Phz和阿米替林有较好分离，但血浆中内源性物质干扰严重，很易引起基线漂移，并且保留时间也较长；后改用0.03mol•L-1醋酸铵和甲醇（23:77）做流动相时，色谱峰很理想。另外，本实验曾分别使用乙醚、正已烷、乙酸乙酯和氯仿为提取剂，提取率都不满意。后发现用乙酸乙酯与二氯甲烷(80:20)作提取剂时，提取率最好。采用乙酸乙酯与二氯甲烷(80:20)一次提取，后用甲醇定容进行紫外色谱分析，所取血浆仅为1.0mL，且进样量20µL便达到实验要求，既提高了灵敏度又减少了样品杂质，保证色谱柱能进行大量样品的连续分析。

参考文献

[1]陈彦方,顾牛范.新编临床精神药物手册[M]山东济南科学技术出版社,1998:7(1)18-19.

[2]宋振铎,胡岱梅,原伟等.奋乃静治疗精神分裂症适宜血浓度研究[J].中国现代医学杂志,2005,7(14):2176-78.

[3]MizunoY,SatoK,SanoTetalIdentificationandcharacterizationof17phenothiazinecompoundsbycapillaryhigh-performanceliquidchromatography/fastatombombardmentmass[J].LegMed(Tokyo),2002,4(4):207-216.

[4]AngeloHR,PetersenA.Therapeuticdrugmonitoringofhaloperidol,perphenazine,andzuclopenthixolinserumbyafullyautomatedsequentialsolidphaseextractionfollowedbyhigh-performanceliquidchromatography[J].TherDrugMonit,2001,23(2):157-162.

[5]MandalTK,AceLN.High-performanceliquidchromatographicdeterminationofperphenazineinplasma[J].JClinPharmTher,1993,18(3):205-208.