大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养

大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养

邹瑾1李雅2尹进3

邹瑾1李雅2尹进3

（1湖南科技职业学院湖南长沙410014）

（2湖南中医药大学湖南长沙410004）

（3湖南疾病预防控制中心湖南长沙410007）

【摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠

【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02

Ratbonemarrowmesenchymalstemcells‘sseparationmethodsandtocultivateZouJin.HunanVocationalCollegeofScienceandTechnology,Hu’nanProvince,Changsha410014,China;LiYa.Hu’nanUniversityofChineseMedicine,HunanProvince,Changsha410004,China;YinJin.TheCentersforDiseaseControlandPreventionofHu’nan,Hu’nanProvince,Changsha410007,China

【Abstract】ObjectiveToexploretheinvitrocultureandpurificationofSDratbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)method.MethodsUsingimprovedthewholebonemarrowadherentmethod,separationandpurificationofrat(for3～4weeks)ofBMSCs,microscopicallycontinuousobservationofcellmorphologychange.ToidentificationcellssurfaceantigenCD11b,CD45andCD90expressionusingflowcytometry.ResultsTheoriginalgenerationofculturedcellsiscircularandspindle,after24hours,mostofthecellsareattached.8～10dayslater,thefusionofupto80%～90%.Afterpurification，extendtheperiodis6～8days.Usingflowcytometryassay,CD11bandCD45werenegative,CD90ispositive.ConclusionsImprovedthewholebonemarrowadherentmethod,whichcaneffectivelytheisolationandcultureofratbonemarrowmesenchymalstemcells,isanidealmethodofcultivation.

【Keywords】Bonemarrowmesenchymalstemcells;Cellculture;Therat

骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是目前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验目的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。

1.材料与方法

1.1材料

雄性SPF级SD大鼠，5～7周，体重110±20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CD11b、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。

1.2方法

1.2.1原代培养BMSCs将经过高压灭菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱臼法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的CO2的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。

1.2.2传代、纯化BMSCs当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用有15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里，1200转/分，离心3分钟，将上清液丢弃，放入新的培养基，吹散后按一比二的比例，进行传代培养，将P1设为其标记，之后进行日常观察细胞的生长状态，直到贴壁细胞的融合现象能够有80%左右的时候，再重复上述的操作步骤，进行反复传代。

1.2.3测定BMSCs的生长曲线选择生长良好的P1、P3、P5的细胞，消化后以1×104/mL接种在二十四孔板中，每日均选取三孔，并计算其细胞的数量，按照一孔计算三次的方式，取其平均数，共计连续培养七天，将培养的时间设为横轴，将细胞数设为纵轴，进行生长曲线的绘制。

1.2.4鉴定BMSCs选择P3的细胞，用混合消化液将细胞进行消化，然后配成细胞的悬液，使用1%浓度的BSA，将封闭液进行10min的封闭处理，然后洗涤PBS三次后，放入FITC荧光标记的CD11b、CD90、CD45抗体中，对照组再放入PBS，在4摄氏度的环境下，进行30min的孵育，1500转/分，离心5分钟，冲洗PBS三次，使用1%浓度的多聚甲醛进行固定，使用FACScan流式细胞仪，进行细胞表面抗原的检测。

2.结果

2.1BMSCs细胞培养的形态

BMSCs在接种24小时后，就能够看到细胞有贴壁的现象。48个小时后，细胞的贴壁现象更加趋于明显，其中细胞的形状主要是椭圆形、圆形这两种。在第三天到第五天的时候，细胞形状变成多边形、二角形、短梭形，并变成集落的生长方式。在第六天到第十天的时候，细胞能够形成80%到90%的融合现象，而且已经将瓶底铺满，分布形状呈现旋涡状，并且能够进行传代。在刚传代的细胞形状为圆形，且传代的细胞，和原代细胞相比，其生长速度更快，在四个小时的时间内，就出现了贴壁的细胞，在二十四个小时内，所有的细胞已经全部贴壁，并且呈现伸展的生长状态，在6天到8天后，就能够进行传代，传代的细胞生长均匀分布，且大部分细胞的形状是梭形。

2.2BMSCs的生长曲线

第1、3、5的细胞生长的曲线形状是S型，和传代后的细胞生长的特征大致相符，传代细胞的潜伏期大概是二十四小时到四十八小时之间，在贴壁2天当中，没有明显的增殖情况，一般在第三天，开始进行对数的增殖期，在第六天到第八天，能够融合80%以上，之后在进入到平台期后，细胞就不再进行增殖。

2.3BMSCs的细胞鉴定

使用流式细胞仪进行检测，观察到第3代的BMSCs细胞的CD45阳性细胞率，没有达到5%，而CD90的阳性率已经超过95%。

3.讨论

BMSCs就是指，由多种没有经过鉴定的细胞，共同组成的细胞群体，其特征主要体现为复杂性和混合性，在骨髓里的BMSCs含量不高，每1万到10万个单核细胞里才存在1个BMSCs[2]。故此，建立成熟的BMSCs的体外分离、培养、纯化和扩增的方法，是能够将BMSCs利用起来，再进行实验研究、临床应用的基础方式。对目前而言，体外分离培养BMSCs，尚未得到公共认可的标准。当下采取的方法主要包括免疫磁珠法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法以及全骨髓贴壁法，其中，免疫磁珠法、流式细胞仪分离法这两种能够获取纯化度更高的BMSCs，但是其弊端在于，这两种方法会对细胞的活性造成一定的负面影响，甚至会导致细胞失去其活性。全骨髓贴壁法，是体外分离培养BMSCs的最早使用的一种方法，在Friedenstein等提出BMSCs的概念时，就是采用的全骨髓贴壁法，其优势[3]在于，操作简单，不会对细胞造成损伤，且细胞的活力能够得到较高的保障；但其存在的最大的弊端就是得到细胞的纯度较低。在鉴定MSCs的纯度时，常规认为其是一种复杂的细胞群体，标记多种多样，没有特定的抗原表面，就目前来说，临床认为其表达的是CD166、CD105、CD90、CD44、CD29等,而不会表达造血细胞表面抗原。

我们的研究结果表明，本次分离培养后得到的细胞当中，在有限的传代数内纯度较高，增殖的传代功能强，是进行细胞移植当中，较为满意的一种种子细胞，其应用前景非常广泛。但是，在培养细胞的过程里，需要注意的是：第一，培养基的PH值，要控制在7.2到7.3的范围内。第二，要选择适合的消化时间，在细胞突起收缩变形的时候，就需要停止。第三，在传代的时候，其细胞密度要控制适宜。

【参考文献】

[1]XiaopingWang,DongmeiHe,LiChenetal.Cell-SurfaceUltrastructuralChangesDuringtheInVitroNeuron-LikeDifferentiationofRatBoneMarrow-DerivedMesenchymalStemCells[J].Scanning:Thejournalofscanningmicroscopy,2011,33(2):69-77.

[2]Chi,N.-H.,Yang,M.-C.,Chung,T.-W.etal.Cardiacrepairachievedbybonemarrowmesenchymalstemcells/silkfibroin/hyaluronicacidpatchesinaratofmyocardialinfarctionmodel[J].Biomaterials,2012,33(22):5541-5551.

[3]Zhao,Y.,Xin,J.,Sun,C.etal.Safroleoxideinducedneuronaldifferentiationofratbone-marrowmesenchymalstemcellsbyelevatingHsp70[J].Gene:AnInternationalJournalFocusingonGeneCloningandGeneStructureandFunction,2012,509(1):85-92.

基金项目：湖南省教育厅科技项目（项目编号12C1095）