纤维素酶提取法与传统提取法在苦参提取中的应用

纤维素酶提取法与传统提取法在苦参提取中的应用

李明松1刘文2田海林1

李明松1刘文2田海林1（1安顺职业技术学院贵州安顺561000）（2贵阳中医学院贵州贵阳550002）

【摘要】目的用苦参提取苦参碱，对其纤维素酶提取法和传统提取法进行对比实验。方法纤维素酶提取法（简称酶提取法），即每克生药加入50U（0.25g）纤维素酶，充分搅拌，其他工艺同原工艺；传统提取法。结果酶提取法提高了苦参碱的收率，与传统提取法相比有显著性差异，P<0.05。结论纤维素酶的加入，提高了苦参碱的收率。

【关键词】纤维素酶酶解技术传统提取法苦参碱含量测定

【中图分类号】R284.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）34-0106-02

TheApplicationoftheCellulase-MethodandTradition-MethodforSophoraFlavescensExtraction

LiMing-song1LiuWen2TianHai-lin1

(1.AnshunVocationalandTechnicalCollege,Guizhou,561000,China;)

(2GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guizhou,550002,China)

【Abstract】Objective：Toextractmatrineinsophoraeflavexcensandtodocomparativeexperimentoftheextractionwithcellulase-methodandtradition-method.Methods:Cellulaseextraction（Itiscalledenzymeextractionforshort），Itmeansadding50U(0.25g)cellulosetoeachgramofcrudedrugandmixwell.Anotherprocessarethesameasoriginalone;Traditionalextraction.Results:Thematrine’syieldisimprovedbytheenzymeextraction.Ithassignificantdifferencetocomparewiththetraditionalextraction,P<0.05.Conclusion:Thematrine’syieldcanbeimprovedbycellulase-adding.

【Keywords】cellulosethetechnologyofenzymatichydrolysistraditionalextractionmatrinecontentdetermination

传统的提取方法有煎煮、浸渍、渗漉、回流等，这些方法存在着一些不足之处，如：煎煮法提取温度高、浸渍法周期长、渗漉法和回流法成本高等。

近年来，在中药提取方面出现了许多新技术，中药酶解技术就是其中的一种。中药酶解技术[1]就是根据植物药材细胞壁是由纤维素构成，利用酶反应所具有的高效专一性[2]，选择相应的酶，将细胞壁水解或降解，破坏细胞壁的组织结构，使其有效成分暴露出来，并溶解于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的新方法，由于植物提取过程中的屏障——细胞壁被破坏，因而酶解有利于提高有效成分的提取率。

根据这一原理，我们选用苦参提取苦参碱[3]作为研究对象，并对酶提取法和传统提取法进行对比实验，来验证纤维素酶对苦参提取苦参碱的影响。

一、实验仪器与药品

纤维素酶粗品（活力单位10000µ/g）批号：F20050512，国药集团化学试剂有限公司；对照品苦参碱（批号：110805-200306）供含量测定用，中国药品生物鉴定所；药材苦参为豆科槐属(Leguminosae)植物SophoraflavescensAit的干燥根,贵阳市花果园药材批发市场提供，经中药鉴定教研室鉴定；高效液相色谱仪（LC5A），日本岛津；所用试剂均为分析纯。

二、实验方法与结果

（一）色谱条件[4]

色谱柱：氨基柱，流动相：乙氰-无水乙醇-3%磷酸溶液（80：10：10）；流速：1ml/min，柱温30℃，检测波长：220nm，在此条件下,药材中苦参碱与其他成分能很好地分离。

（二）标准品溶液的制备

精密称取苦参碱标准品,置10ml容量瓶中,加甲醇溶解至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.002、0.014、0.026、0.050、0.062、0.074、0.086mg\ml的苦参碱标准溶液。

（三）从苦参中提取苦参碱的原工艺(供试品的制备方法)

称取苦参药材约50g，精密称定，加水400ml，HCL调PH4.5，置于50℃的水浴中浸泡15min，煎煮两次,每次30min，滤过，合并滤液，浓缩至约200ml，离心（3000r/min）10min，取滤液转移至250ml容量瓶中，加水定容到刻度，摇匀，用10ml移液管精密吸出10ml，然后分别用20、20、15、15ml氯仿萃取四次，挥干氯仿，加入甲醇溶解并转移至10ml容量瓶中，加甲醇定容到刻度，即得。

（四）线性范围的考察

精密吸取浓度为4.024µg•ml-1的苦参碱对照品溶液0.5µl、3.5µl、6.5µl、9.5µl、12.5µl、15.5µl、18.5µl、21.5µl，按色谱条件进样，测定峰面积。以苦参碱对照品(x,mg•ml-1)为横座标，峰面积积分值（y）为纵座标进行线性回归，见表1，图4和5，得回归方程为Y苦=1.2829•10-4X-2.1811•10-4，r=0.9962，苦参碱在0.0141～0.0865mg•ml-1范围内呈良好线性关系。

（五）稳定性实验

取苦参样品按2.1供试品溶液的制备方法制备测定，分别于0、2、4、6、8h后后注入高效液相色谱仪中，每次进样20μl,测定苦参碱和氧化苦参碱峰面积，供试品中苦参碱面积在8小时内基本不变，苦参碱峰面积积分相对偏差ＲＳＤ=0.77%，稳定性良好。

（六）重复性实验

取同一批苦参样品按2.1供试品溶液的制备方法制备5份供试液,精密吸取供试品溶液各20µl,注入高效液相色谱仪，测定苦参碱峰面积积分值,计算含量，求得相对标准偏差ＲＳＤ=0.52%。说明本实验方法的重复性良好。

三、酶提取法与其他几种传统提取方法对照比较

为了验证正交实验所得的最佳参数结果，在酶提取法中使用最佳参数值。将酶法提取出的生物碱与传统提取方法提出的生物碱进行比较。

（一）酶提取法[5]

称取1份厚度为0.5cm的苦参饮片约50g，精密称定，加入8倍量酸水PH=4.5，以每克生药材50U的量加入纤维素酶，充分搅拌，置于55℃的恒温水浴内浸泡15min，酶处理后提取工艺同原工艺制备，即得。

（二）传统提取法

1.热浸渍法称取1份厚度为0.5cm的苦参饮片约50g，精密称定，加入8倍量的酸水，55℃水浴恒温浸渍120min，过滤，药渣再分别浸渍两次，每次加入8倍量的酸水，方法同前，合并三次滤液，浓缩至250ml左右，3000r/min离心10min,转移到250ml容量瓶中，加水稀释到刻度，摇匀，用10ml移液管精密吸取10ml水提液倒入分液漏斗中，加入氨水用酸度计调PH=10左右，用60ml氯仿分三次萃取，合并氯仿层，挥干，加入甲醇溶解，定容到10ml容量瓶中，即得。

2.渗漉法精密称取1份质量约为50g的苦参最粗粉，先用8倍量的酸水PH=4.5浸泡，55℃水浴恒温30min后，装在渗漉器中，HCL渗漉，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，控制流速，使药材中有效成分充分浸出为止，收集渗漉液500ml，过滤除去脂溶性杂质，在滤液中加入氨水调PH=10，用60ml氯仿分三次萃取，合并氯仿层，挥干，加甲醇溶解，定容到10ml容量瓶中。

3.煎煮法称取1份厚度为0.5cm的苦参饮片约50g，精密称定，提取方法按2.1供试品的制备方法制备，即得。

4.回流提取法称取1份厚度为0.5cm的苦参饮片约50g，精密称定，置于圆底烧瓶内，加水浸没药材表面，HCL调PH=4.5，浸泡90min，水浴加热，回流提取60min，过滤，药渣再回流提取两次，方法同前，合并滤液，浓缩至20ml，过滤除去脂溶性杂质，在滤液中加入氨水调PH=10，用60ml氯仿分三次萃取，合并氯仿层，挥干，加入甲醇溶解，定容到10ml容量瓶中，即得。

（三）酶提取法与传统提取法的含量测定

取出各法所制得的滤液，将提取的样品放入液相色谱仪中检测出相应的峰面积，进行含量测定，测定方法同上。实验结果见表1；方差分析见表2，所示：

表1酶提取法与传统提取法提取苦参生物碱的含量比较表

实验方法实验一药材重量(g)苦参碱含量(mg﹒g﹣1)实验二药材重量(g)苦参碱含量(mg﹒g﹣1)

热浸渍法150.03950.1235250.04470.1256

渗漉法150.01160.3121250.03100.3577

煎煮法150.01480.2198250.03980.3155

回流提取法150.07580.1064250.03240.1306

酶提取法150.04120.4352250.02170.4385

表2苦参碱方差分析表

变异系数SSdfMSF比F临界值P显著性

组间0.15040.03831.7205.1920.001**

组内0.00650.001

总计0.1569

注:﹡P﹤0.05

从实验表中可看出，酶提取法得到的苦参生物碱含量较其他几种传统提取法得到的要高，说明酶提取法与其他几种传统提取法相比，具有高效、快速、省时、操作简便等优点。

四、小结与讨论

从实验中可以看出在纤维素酶的作用下，提高了苦参碱的收率。与对照组（传统提取法）相比，有显著性的差异，P<0.05。我国应用中药大部分属于植物类药材，特别是富含纤维素的根、茎、皮类药材，应用纤维素酶可以破坏植物的细胞壁而使有效成分提取率提高，使药材得到充分利用。

参考文献

[1]韩丽主编.实用中药制剂新技术[M].化学工业出版社,2002年第1版,2002:118.

[2]郭勇主编.酶的生产与应用[M],化学工业出版社,2003年第1版,2003:11～12.

[3]李晓海.HPLC法在生物碱分析中的研究进展[J].中草药,2002,33(4):368.

[4]国家药典委员会编著.中华人民共和国药典.化学工业出版社,2005年第1版,2005,一部:161.

[5]马桔云,赵晶岩,姜颖等.纤维素酶在黄连提取工艺中的应用[J].中草药,2000,31(2):103.