分离SD大鼠肝脏HSC细胞的改良方法

分离SD大鼠肝脏HSC细胞的改良方法

洪伦雷海波

湖南省职业病防治院职业病1科湖南长沙410013

摘要：目的：探寻一种SD大鼠HSC（星状）细胞分离改良法，为肝细胞相关基础实验提供细胞原料。方法：应用存在密度梯度的分离液（浓度11.3%），应用一步梯度离心法分离肝HSC细胞。应用台盼蓝染色法鉴定HSC细胞存活率，及desmin免疫细胞染色法鉴定HSC纯度。结果：肝脏HSC细胞得率约（3.7±0.5）X107个/SD大鼠，HSC细胞存活率约85%，纯度达到90%。结论：本法为一种简便、高产分离SD大鼠肝HSC细胞的方法，可予推广。

关键词：SD大鼠；肝HSC细胞；细胞分离；细胞鉴定

近年来流行病学调查及动物实验均表明达到一定浓度的砷可引起不同程度的肝毒性，其中包括肝纤维化、肝硬化、肝癌等，危害人体健康[1]。而肝纤维化就是造成肝硬化、肝癌等的主要致病病理过程，它本质是一种多原因引起、涉及多种病理机制和具有多种病理表现的疾病，实质是肝内细胞外基质合成大于降解，导致大量细胞外基质过度沉积肝HSC（星状）细胞是产生细胞外基质的主源，各类肝纤维化均存在通过静息态的HSC细胞表型转化为成纤维细胞表型这一过程，参与肝纤维化的病理发展[2]。肝HSC细胞的相关研究目前主要依靠细胞层面相关实验，寻找其病理生理及分子层面上的特征尤为热点，故寻找一种高细胞获得率的肝HSC细胞的分离法就显得尤为重要。由于肝HSC细胞的比重与淋巴细胞等有交叉且易与肝细胞易互吸附，使得纯化不易。我们综合文献[3]及摸索实验，研讨一种分离SD大鼠肝脏HSC细胞的改良法，介绍如下。

1材料

1.1实验动物

SD大鼠来自本院动物房，体重400-450g，自由进食普通饲料及饮水。

1.2主要试剂

密度梯度离心介质、链酶蛋白酶E为上海西唐公司产品；兔抗鼠desmin抗体、免疫组化试剂盒、显色试剂盒均为武汉博士德产品。

1.3主要仪器

倒置显微镜、细胞培养箱、水浴箱、电磁加热器。

1.4主要用液

1.4.1NYO缓冲液：

EDTA-Ca110.2mg，Tris-HCl585mg，KCl212.6mg，。配置后调节pH=7.5，分装后低温保存。

1.4.2NYO分离稀释溶液：

NYO36g加入NYO缓冲液150ml/200ml/250ml/300ml，配置成不同浓度，低温保存。

1.4.3消化液及灌流液：

链酶蛋白E200mg，加入小牛血清250ml。取180ml加入胶原酶80mg缓冲液，作为灌注液；余下70ml加入100mg小牛血清制成细胞消化液，均过滤除菌处理。

1.4.4细胞悬浮液

牛血清白蛋白100mg，加入D-Hanks100ml中，每ml中混合10mgDNA消化酶。

2方法

2.1肝脏细胞粗分离

将新得到的大鼠肝脏剪碎后放入形瓶，加入消化液后予加热搅拌，370C，250r/min，40min。

2.2肝HSC细胞纯化

将粗分离消化后的混合肝各细胞悬液滤入离心管，1500rpm，15min。用悬浮缓冲液重悬浮，得到最后体积为10ml。加入18ml的20%的NYO溶液混合，再加入5ml的悬浮缓冲液，40C，1500g，20min离心完毕后，吸取上层细胞，转移到50ml离心管，加入3倍体积的悬浮缓冲液，40C，1500rpm，15min。

2.3细胞培养

得到的细胞接种于培养皿，370C5%CO2，培养箱中培养48h后，每2天换液。

2.4统计学分析：得到数据用均数±标准差表示。

3结果

3.1不同浓度分离液所分离细胞密度比较（表1）

3.2细胞计数及存活率

细胞计数板法测定细胞数，SD大鼠的肝HSC细胞数得率为（3.7±0.5）X107个；台盼蓝据染法测细胞存活率约85%。

3.1细胞染色鉴定

desmin免疫组织染色显示阳性细胞达90％以上（图1）。

4讨论

本提取实验为采用缓冲液与NYO溶液混合法分离HSC细胞，胶原酶消化细胞基质；链酶蛋白酶E用来去除主要的肝细胞杂质。实验过程中为尽量保证所提取HSC细胞的完整性，时间均为反复摸索。

为得到纯度更高的SD大鼠肝HSC细胞，我们选择注意了以下实验要点：（1）实验鼠为SD大鼠，体重保证在400g以上，需营养健康状况良好。（2）讲消毒处理的圆木块加入细胞分离缓冲液，圆木块对悬浮缓冲液起缓冲的作用，使含细胞的缓冲悬浮液缓慢分离。（3）肝细胞为主要杂质干扰细胞，为了进一步去除其干扰，原位消化后后得到的细胞液继续体外消化。消化的过程中，肝HSC细胞易与肝细胞及其他细胞碎片粘附，因此，本实验过程中使用加入DNA酶的小牛血清的分离液，充分避免与其他杂质细胞的粘附，并同时使用加热搅拌器来加强各不同细胞间的分离，以得到相对高纯度的HSC细胞。

不同的实验人员及实验时间可能对最终提取结果有一定影响，多次实验把握细胞液在缓冲悬浮液缓慢分离时的细节，及NYO溶液的纯度是实验成功的关键。研究砷对肝脏纤维化作用动物实验中，获得存活的肝HSC细胞是研究基础，本方法简便易行，细胞活率及纯度相对高，可在基层研究实验室推广。

参考文献：

[1]李玲，吴君，蒋玲，等.不同价态饮水型砷暴露对小鼠肝脏的损伤作用[J].第二军医大学学报，2008，29（5）：499-503.

[2]SenooH，YoshikawaKetal.Hepaticstellatecell（vitaminA-storingcell）anditsrelative--past，presentandfuture[J].CellBiolInt，2010，34（12）：1247-72.

[3]翁山耕，冷西圣，魏玉华，等.改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定[J].北京大学学报（医学版），2001，33（1）：83-6.