Taqman实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达水平

Taqman实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达水平

周晓犊

周晓犊(杭州艾迪康医学检验中心有限公司浙江杭州310023)

【摘要】目的建立快速检测非小细胞肺癌患者PTEN、VEGF和RRM1mRNA表达水平的体系，并对表达水平进行评价。方法以正常人外周血构建PTEN、VEGF、RRM1和管家基因actin的定量标准曲线，利用实时荧光定量PCR法中的“双标准曲线”模型对80例肺癌患者和200例正常人的上述基因表达水平进行检测。结果标准曲线呈良好的线性关系。PTEN和VEGF基因在非小细胞肺癌组织中表达分别显著高于和低于正常组织，PTEN、VEGF基因表达与患者的性别、组织学类型无关，而与P-TNM分期存在显著相关性。两者的基因表达呈负相关。RRM1基因表达与患者的性别、组织学类型以及P-TNM分期均不存在显著相关性。结论Taqman实时荧光定量PCR法能够较好的对非小细胞肺癌患者体内PTEN、VEGF和RRM1mRNA表达水平进行定量检测并给予客观评价，为后期的治疗和用药提供可靠的依据。

【关键词】荧光定量PCRPTENVEGFRRM1表达水平

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）20-0079-03

如今，肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据病理学分类，确诊的肺癌中约80%-85%为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)。由于缺乏有效的早期诊断手段，初诊时约75％的患者已失去了手术时机，目前，预测NSCLC患者化疗反应主要指标还不甚明确。有观点认为，应当引入个体化的分子标志物指标，以实现非小细胞肺癌个体化治疗和预测[1-2]。

PTEN是1997年发现的新抑癌基因，也是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因[3]，位于染色体10q23，其表达产物PTEN蛋白具有诱导细胞凋亡、抑制细胞周期进展以及抑制细胞迁移、铺展和局部黏附的生理功能[4]。研究表明PTEN基因突变缺失及PTEN蛋白的低表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。VEGF是机体最重要的自分泌生长因子，能特异结合血管内皮细胞，使大分子物质和肿瘤细胞穿透血管进入血液循环，与肿瘤的生长转移有关[5]。肺癌侵袭性生长、转移和预后依赖于血管生长[6]。RRM1基因定位于染色体1lq15.5区域[7]，这是多种恶性肿瘤杂合性易失(1ossofheterozygosity，LOH)区域，称为LOH11A，该区域与恶性肿瘤的转移有关系，约75%的NSCLC患者有这样的杂合性缺失。

现有国内的文献报道中，对肿瘤抑癌基因表达水平的定量检测多采用荧光原位杂交（FISH）[8]，尽管该法是现阶段肿瘤诊断的“金标准”，但是由于存在费时费力、结果判读困难等缺点而难以被广泛使用。随着分子生物学的快速发展，实时荧光定量PCR法以其“实时性”、快速高效、高灵敏度和高特异性等优势逐步被人们所接受，该法可快速、精确的反映患者体内分子靶标的表达情况，还可避免发生污染。因而本研究采用实时荧光定量PCR法对非小细胞肺癌患者的PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达水平进行检测，旨在建立荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达水平的方法和评价体系。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

反转录试剂盒：ReverTraAceqPCRRTKit（TOYOBO）；荧光定量试剂盒：THUNDERBIRDProbeqPCRMix（TOYOBO）；RNA抽提试剂盒：RNeasyFFPEKIT（QIAGEN）；TRIzolReagent:（Gibco）；常规PCR仪：ABIVERITIPCR仪；荧光定量PCR仪：ABI7500荧光定量PCR仪；核酸浓度检测仪：NanoDrop2000micro-volumespectrophotometer（THERMO）。

1.2研究对象

非小细胞肺癌患者石蜡切片样本均取自杭州艾迪康医学检验中心病理组。样本均为2011年-2012年间外科手术切除的肺部病变组织，共80例样本，样本信息见表1。正常人的肺部组织切片200例，平均年龄58±4.3岁，作为对照组。另于艾迪康医学检验中心下属体检中心取50例正常人抗凝血样（EDTA抗凝）1ml，以此作为绘制标准曲线的样本。

表1非小细胞肺癌患者石蜡切片样本信息

Tab1TheinformationofNSCLCparaffinsample

1.3RNA提取、cDNA合成及荧光定量PCR反应

刮拭2-3片石蜡切片上的组织于1.5ml的RNase-free离心管中，参照RNA抽提试剂盒FFPERNeasykit（QIAGEN）的说明对组织RNA进行抽提；对于全血样本，RNA抽提采用TRIzol法[9]进行。得到的RNA均用NanoDropThermo测定浓度和纯度，选择浓度介于50ng/ul～200ng/ul、260nm/280nm吸光度比值介于1.9-2.1，且电泳检测中26S、18S、5S条带清晰的样本进行后续实验。

RNA经反转录试剂盒得到cDNA。反应体系及程序如下：第一步体系：Randomprimer：1ul，RNase-freedH2O：3ul，RNA模板：4ul。程序为65℃5min后冰浴2min；第二步体系：5×RTBuffer：4ul，EnzymeMix:1ul，RNase-freedH2O:7ul。反应程序为：37℃15min后98℃5min。得到的cDNA置于-30℃备用。

利用ABIPrimerExpress3.0软件设计看家基因（actin）和目的基因的荧光定量扩增引物及探针，引物和探针均由invitrogen公司合成。引物探针序列见表2。荧光定量PCR反应体系如下：THUNDERBIRDProbeqPCRMix：12.5ul，引物（10μM）：正、反向引物各0.8ul，TaqManProbe（10μM）：0.4ul，ROXReferenceDye(50×)：0.5ul，RNase-freedH2O：8ul，模板cDNA：2ul，总体系25ul。反应程序在ABI7500上进行，程序为：预变性95℃1min，变性95℃15sec，退火和延伸58℃35sec。40个循环。

表2引物探针序列

1.4数据分析方法

采用双标准曲线法对基因表达水平进行测定。首先将正常人全血的cDNA进行7个梯度（10倍稀释）的线性拟合后，分别构建管家基因和目的基因的定量标准曲线。然后将200例对照组中的目的基因浓度与看家基因浓度进行比较，通过统计分析分别计算出PTEN、VEGF、RRM1的正常相对表达范围。最后将患者的目的基因和管家基因浓度之比与对照组得出的范围进行比较：低于正常范围下限定为低表达，高于正常范围上限的定为高表达，落在正常范围内的定为正常。

所得结果利用SPSS13.0版统计分析软件中的x2检验进行，独立样本one-wayANOVA检验法分析不同组织类型及临床分期的癌变组织以及癌变组织与正常组织表达水平的差异，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2结果

2.1RNA纯度及质量分析:

经NanoDrop2000软件分析，提取所得患者石蜡样本的总RNA的D260nm/D280mn均在1.9-2.1之间。浓度均在50ng/ul以上。琼脂糖凝胶电泳成像显示清晰的28S及18S条带，无明显5S条带降解。能够用于100bp以下片段的扩增。

图1石蜡样本总RNA电泳结果

Fig.1thegelelectrophoresisoftotalRNAfromparaffinembeddingsample

2.2目标\内参基因的标准曲线

将正常人的浓缩cDNA进行7个梯度的倍比稀释后进行实时荧光定量法检测。将所得到的Ct值与标准品的浓度对数值作图，拟合得标准曲线(图2-图5)。各基因的Ct值与不同浓度的对数值之间呈现良好的线性关系，R2均大于0.99，扩增效率均在85%以上。批次间的重复性较好（RSD<1%），

2.3对照组PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达水平

200例正常肺部组织的PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达水平检测结果发现，三个位点的相对表达值均在较小的范围内浮动。其中PTEN的正常值范围为：0.77-1.07，中位数值为0.95，标准差0.447；VEGF的正常范围为：20.26-29.97，中位数值为27.74，标准差12.74；RRM1的正常范围为：3.72-9.80，中位数值为6.72，标准差6.41。显示PTEN、VEGF、RRM1三个基因在正常人体内表达较为稳定。

2.4非小细胞肺癌组织PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达

对80例非小细胞肺癌患者组织中PTEN、VEGF、RRM1mRNA表达量进行实时荧光定量检测。以对照组中得出的正常范围为标准，分别按照性别、组织学类型、临床分期对检测结果进行了分类统计（表3）。

表3患者临床特征与PTEN、VEGF和RRM1mRNA表达的关系

Tab1RelationshipbetweenclinicalcharacteristicsandexpressionofPTEN，VEGFandRRM1mRNA

表4肺癌患者PTEN、VEGF和RRM1mRNA表达水平x2分析

Tab2Thex2analysesofPTEN，VEGFandRRM1mRNAexpression

注：x20.05（6）=12.59，x20.01（6）=16.81，x20.05（2）=5.99，x20.01（2）=9.21

*表示差异显著；**表示差异极其显著

80例非小细胞肺癌组织样本中，PTEN总体低表达率75%，高表达率仅为6.25%。男女之间差异不显著。鳞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌低表达率分别为60%、70%、80%、90%；而临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期中的低表达率分别为45%、65%、95%、95%；x2检测结果显示PTENmRNA表达水平在不同组织学类型间无显著相关性(P>0.05)，而在不同临床分期间则存在极显著的差异(P<0.01)，Ⅲ期、Ⅳ期的表达水平显著低于Ⅰ期、Ⅱ期。

VEGF在肺癌组织样本中总高表达率82.5%，低表达率为5%。男女患者的高表达率分别为86%和73%，其中鳞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌的高表达率分别为70%、75%、90%和95%，p-TMN临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期高表达率分别为65%、70%、95%和100%。x2检测结果显示VEGFmRNA表达水平与患者性别和样本组织学类型无显著相关性(P>0.05)，只与临床分期显著相关(0.01<P<0.05)，Ⅰ期、Ⅱ期的表达水平显著低于于Ⅲ期、Ⅳ期。结合中表达和低表达的结果，显示出PTEN与VEGF在肺癌组织中的表达情况呈负相关的趋势。

RRM1在肺癌组织样本中总低表达率42.5%，高表达率30%。男、女患者的高表达率分别32.5%和27%；其中鳞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌低表达率分别为50%、55%、35%、30%；高表达率分别为20%、20%、40%、40%，从临床分期上看，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的低表达率分别为50%、45%、40%、35%；高表达率分别为20%、25%、30%、45%。x2检测结果显示RRM1mRNA表达水平与患者性别、样本组织学类型和临床分期均无显著相关性(P>0.05)。

3讨论

有研究表明PTEN蛋白在正常肺组织、肺良性病变和非小细胞肺癌中的表达差异具有显著性，并且PTEN蛋白的表达降低及缺失多发生在肺癌中晚期[10]。本研究的结果显示PTEN蛋白在肺癌组织中的表达与表征组织分化程度的p-TNM分期明显相关，提示PTEN蛋白的丢失使肺癌细胞脱离了原有的正常生长调控状态，细胞无节制生长趋势加剧，即PTEN表达率越低，细胞分化程度越低，肿瘤的恶性程度越高。这一结论与池闯等[11]、李波等[12]的研究结果恰好吻合。PTEN是现今发现的重要肿瘤抑制基因之一，但是由于PTEN失活导致的表达水平降低却能介导肿瘤对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂、顺铂、阿霉素和紫杉醇等药物的耐受性，从而降低化疗药物的作用，因而检测患者癌变部位PTEN表达水平对于选择化疗药物有很好的指导作用。

VEGF是参与肿瘤血管形成作用最强和特异性最高的生长因子。本研究中NSCLC患者中VEGF的表达率明显高于正常肺组织，这与ToomeyDetal[13]以及姜昕[14]等的结果基本一致，另外，VEGF在NSCLC中的表达情况，在不同p-TNM分期中存在显著差异（0.01<P＜0.05），而在组织学分类间则差异不显著(P>0.05)，这一结果也与孙江涛[15]、Ito等[16]的报道相符。近年来，贝伐单抗已被用作针对VEGF的靶向化疗药物，临床研究证实，VEGF基因表达水平高的患者的相较于表达水平低的患者，其中位无进展生存期较长，疗效明显。因而对于患者VEGF表达水平进行检测，是个体化治疗成败的关键因素。

核苷酸还原酶(ribonucleotidereductase,RR)是细胞存活的关键酶。其中RRM1是核苷酸结合位点，控制底物的特异性和整个酶的活性，同时也是核苷类似物系的化疗药物的结合位点[17]。吉西他滨作为晚期非小细胞肺癌的一线治疗药物在临床上已广泛应用。但是，个体差异对化疗疗效仍有着显著影响，已有研究证实患者对吉西他滨治疗的敏感性与肿瘤组织RRM1基因的表达水平相关。其中RRM1基因表达水平较低的患者要比表达量高的患者有更好的预后及更长的生存期。本研究中，整体低表达率为42.5%，低于江波[18]报道的比例，这可能与样本量和采样方法有关；其中鳞癌、腺癌的低表达率分别为50%和55%，这与BeplerGetal[19]的结果相近。另外，结果中提及的“RRM1mRNA表达水平与患者性别、样本组织学类型和临床分期均无显著相关性”的论断在刘德森等、高志强等[20-21]的报道中也得到了证实。

在以往的报道中，用于检测耐药基因表达水平的方法大多为荧光原位杂交（FISH），尽管该法观察较为简便，但是试验结果需要经验丰富的人员来判读，因而结果存在较大的主观性。实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,且能对PCR产物量进行实时监测,可准确反映患者PTEN、VEGF、RRM1mRNA的表达情况，不仅节约了检测时间，还避免了污染的发生。常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中染料法的特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法法，而双探针法杂交法又较为昂贵，因此现阶段采用的多为Taqman探针法。

近年来，肺癌诊断和多模式治疗有了长足的发展，但是预后仍然不容乐观，其中最主要的原因之一是化疗药物耐药性的存在。随着药理遗传学和药理基因组学的迅猛发展，已发现多个肺癌耐药相关的基因，并将其作为肺癌耐药分子的标志，应用于研究和临床治疗。本研究的意义在于建立以荧光PCR技术结合Taqman探针方法为基础，以非小细胞肺癌患者PTEN、VEGF、RRM1为目标基因的快速检测体系，并对耐药基因的表达水平进行评价，为后期的用药提供指导。尽管本研究所采用的样本类型和样本数量还有待扩充，所得出的正常表达范围还有待进一步确认，这些都将在后续的研究中不断完善。

参考文献

[1]OLAUSSENKA，DUNANTA，FOURETP，etal.DNArepairbyERCC1innon-smallcelllungcancerandcisplatin-basedadjuvantchemotherapy[J].NEnglJMed，2006，355(10):983-991.

[2]OLAUSSENKA，FOURETP，KROEMERG.ERCC1-specificimmunostaininginnon-smallcelllungcancer[J].NEnglJMed，2007，357(15):1559-1561

[3]LIJ，YENC，LIAWDU，etal.PTEN，aputativeproteintyrosinephosphatasegenemutatedinhumanbrain，breastandprostatecancer[J].Science，1997，275(5308):1943-1947.

[4]吴元清.PTEN在非小细胞肺癌研究中的进展[J].国外医学:生理病理科学与临床分册，2003，23(6):577.

[5]KrollJ，WaltenbergerJ.Regulationoftheendothelialfunctionandangiogenesisbyvascularendothelialgrowthfactor-A[J].ZKardiol，2000;89(3):206-218

[6]YanoT，TanikawaS，FujieT，etal.Vascularendothelialgrowthfactorexpressionandneorascularisationinnon-smallcelllungcancer[J].EuroJCancer，2000;36(5):601-609

[7]BeplerG．UsingtranslationalresearchtotailortheuseofchemotherapyinthetreatmentofNSCLC[J]．LungCancer，2005，10(50)Suppl1:S13-14．

[8]JemalA，SiegelR，WardE，etal.Cancerstatistics[J].CACancerJClin，2008，58(2):71-96.

[9]DSimms，PE.Cizdziel，PChomczynski.TRIZOL?:anewreagentforoptimalsingle-stepisolationofRNA[J].FOCUS，1993:99-102

[10]IwanagaK，YangY，RasoMG．etal．PteninactivationacceleratesoncogenicKras-initiatedtumorigenesisinamousemodeloflungcancer[J].CancerRes，2008，68(4):1119-1127．

[11]池闯，孙成超，万丽，等.VEGF和PTEN在非小细胞肺癌中的表达[J].温州医学院学报，2010，40(4):381-385

[12]李波，杨鲲鹏.非小细胞肺癌中PTEN、VEGF、TSP-1的表达与血管生成相关性的研究[J].医学信息内、外科版，2009，5(22):415-417

[13]ToomeyD，SmythG，CondronC，etal.Immunefunction，telomerase，andangiogenesisinpatientswithprimary，operablenonsmallcelllungcarcinoma:tumorsizeandlymphnodestatusremainthemostimportantprognosticfeatures[J].Cancer，2001，92(10):2648-2657.

[14]姜昕，周建华，邓征浩，等.Notch1，Jagged1和VEGF蛋白在非小细胞肺癌的表达及其意义[J].中南大学学报:医学版，2007，32(6):1031-1036.

[15]孙江涛，周清华，车国卫，等.非小细胞肺癌中VEGF表达、MVD值与临床病理特征相关性研究[J].山东医药，2006，46(19):44-45.

[16]ItoH，OshitaF，KamedaY，etal.Expressionofvascularendothelialgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorinsmalladenocarcinomas[J].OncolRep，2002，9(1):119-123.

[17]SmithBD，JudithE.Ribonucleotidereductase:anoldtargetwithnewPotential[J].LeukemiaRes，2003，27(12):1075.

[18]江波.RRM1与非小细胞肺癌吉西他滨化疗耐药相关性的研究进展[J].实用癌症杂志，2010:25（5）:544-545

[19]BeplerG，GautamA，LaurenM，etal.Prognosticsignificanceofmoleculargeneticaberrationsonchromosomesegment11p15.5innon-smallcelllungcancer[J].JClinOnco，2002，20(5):1353.

[20]刘德森，杨志坚，陈发龙，等.RRM1基因的表达对晚期非小细胞肺癌化疗效果及预后的影响[J].广西医科大学学报，2010，27（4）:553-555

[21]高志强，韩宝惠，沈洁，等.晚期非小细胞肺癌组织中ERCC1、RRM1和BRCA1的表达研究[J].上海交通大学学报，2011，31（3）:290-294．