塞来昔布与糖尿病肾病相关性分析研究

塞来昔布与糖尿病肾病相关性分析研究

李双王晓梅于扬

李双王晓梅于扬

（辽宁大连大学附属中山医院116001）

【摘要】目的探讨塞来昔布与糖尿病大鼠肾病治疗中的作用机理。方法55只大鼠分成对照组及模型组，模型组通过采用4周高糖高脂包含本合链脲佐菌素（STZ）诱导的方法来制备类似糖尿病的动物模型，然后随机将大鼠分成对照组、糖尿病组及治疗组，给药4周后测血肌酐、尿肌酐、尿微量白蛋白、血糖的变化，同时行各组肾组织中核转录因子κB（NF—κB）、CD68免疫组织化学检测并作相关分析。结果给药4周后与正常对照组相比，糖尿病未治疗组血糖及肌酐清除率（Ccr）、尿微量白白蛋白、肾重/体重增加明显（P<0.01）；与糖尿病未治疗组相比，治疗组血糖及Ccr、尿微量白蛋白、肾重/体重均降低（P<0.05）；血胰岛素水平各组间差异无显著意义；糖尿病未治疗组肾组织中NF—κB、CD68的表达较正常对照组明显增加，给药4周后NF—κB、CD68的表达下降。结论塞来昔布在糖尿病肾病的早期治疗中有明显的保护作用，其机制部分在于抑制了NF—κB的表达，减轻肾组织中单核/巨噬细胞的浸润。

【关键词】塞来昔布糖尿病血糖血胰岛素肾重/体重

【中图分类号】R587.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）36-0014-02

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的严重并发症，其主要病理改变表现为细胞增殖与肥大、肾小球细胞外基质（ECM）积聚及单核—巨噬细胞的浸润，而细胞因子与粘附分子是引起上述变化的主要因素。NF—κB作为一种非常重要的核转录因子，广泛参与细胞因子及粘附分子的转录调节，在2型糖尿病中的作用正受到越来越多的关注。近来国内外一系列针对选择性环氧化酶2（COX-2）抑制剂治疗糖尿病大鼠模型的实验中均得出选择性COX-2抑制剂具有肾脏保护作用，他们通过观察选择性COX-2抑制剂对前列腺素合成的影响，对TGF—β1的抑制等方面来说明它的肾脏保护作用机理[1]。而目前尚未有关于选择性COX-2抑制剂对NF—κB影响的相关报道。我们通过建立糖尿病大鼠模型，观察选择性COX—2抑制剂对肾组织中NF—κB活化的影响以及NF—κB活性改变与肾组织单核—巨噬细胞浸润的关系来进一步探讨选择性COX-2抑制剂在糖尿病中的肾脏保护机制。塞来昔布属于选择性环氧化酶2，（COX-2）抑制剂中均发现肾组织中COX-2表达增强[2，3]，得出选择性COX-2抑制剂具有肾脏保护作用[4，5]，他们通过观察选择性COX-2抑制剂对前列腺素的影响，对TGF-β1的抑制等方面来说明它的肾脏保护作用机制，而本实验中通过建立糖尿病大鼠模型，观察选择性COX-2抑制剂对肾组织中的CTGF调节来进一步阐述其作用机制。进一步探讨高选择性环氧化酶抑制剂-塞来昔布，对改善糖尿病血管炎性病变，延缓糖尿病慢性并发症，特别是对预防和减轻糖尿病肾病有着十分重要的作用。

1材料和方法

1.1糖尿病模型的建立选取健康雄性Sprague-Dawley大鼠55只，体重180－250g，由大连医科大学实验动物中心提供，分笼温室饲养，自由进食饮水，术前禁食12小时，随机分成两组：对照组（n=15），喂以常规饲料；模型组（n=40），喂以高糖高脂饲料（常规饲料加25%蔗糖、15%猪油）。饲养1个月后测空腹血糖（FBG）及血浆胰岛素水平（FINS）并计算胰岛素敏感性指数：ISI=-In（1/FBG×FINS）。

NF-KB单克隆抗体，CD68单克隆抗体分别购自Stantacruz公司。塞来昔布购自美国辉瑞公司。STZ购自美国Sigma公司。OneTouchⅢ血糖测定仪为美国强生Lifescan公司产品。透射电子显微镜为日本产JEM-1200EX。

1.2造模和分组

40只大鼠腹腔内注射等体积枸橼酸盐溶液。DN大鼠随机分为糖尿病组（n=15）和塞来昔布灌胃组即治疗组（n=15）。DN模型建立第二天，塞来昔布灌胃组大鼠经口灌胃塞来昔布50mg/kg,2次/天，DN组灌等体积生理盐水。各组大鼠单笼喂养，自由进食，饮水。于大鼠血糖升高后，每月测体重及空腹血糖(FBG)及血浆胰岛素水平（FINS），并计算胰岛素敏感性指数：ISI=-In（1/FBG×FINS）。所有大鼠饲养8周。除去死亡及血糖恢复正常大鼠，最终每组15只入组。

1.3生化指标血糖测定，采用OneTouchⅢ血糖测定仪和试纸条，胰岛素测定采用成都华西糖尿病科技开发研究所的免疫活性胰岛素放射免疫试剂盒。血肌酐，尿肌酐，尿微量白蛋白采用全自动生化分析仪测定。

1.4组织病理学观察。8周后大鼠采血完毕，即打开腹腔分离大鼠肾脏，称重后以10%多聚甲醛溶液中固定，行全层石蜡包埋，4um连续切片。行PAS染色，光镜下观察肾组织形态学改变。

1.5肾组织中NF-KB，CD68免疫组织化学检测。选择NF-KB单克隆抗体，CD68单克隆抗体，采用SP法。结果采用HPIAS-1000型医学图像分析系统进行分析，每张标本按顺序选15个肾小球视野，分别检测每个肾小球视野内NF-KB（胞核），CD68（胞浆）阳性细胞数，最后以每组的均值进行比较。

1.6统计学处理用SAS数据系统进行统计学分析，数据以(χ-±s）表示，实验组各组间及组内比较采用t检验，方差分析，相关分析采用直线相关。应用SPSS13.0分析软件进行统计分析，p<0.05作为差异显著性指标。

2结果

2.1各组大鼠血糖，血胰岛素，Cre，尿微量白蛋白，肾重/体重的变化，高糖饮食1月后，模型组大鼠FBG与对照组比无明显差异（P>0.05）,FINS较对照组显著增加（P<0.01）,胰岛素敏感性指数上升（P<0.01）。注射STZ后2周，模型组动物空腹血糖明显升高，达到糖尿病诊断标准，其血浆胰岛素值略下降，虽然仍然高于对照组，但差异无显著意义。见表1。给药8周后与正常对照组相比，糖尿病组血糖及Scr、尿微量白蛋白、肾重/体重增加明显(P<0.01）。与糖尿病组相比，治疗组血糖及Scr、尿微量白蛋白、肾重/体重均低(P<0.05）。血胰岛素水平各组间无统计学差异。见表2。

2.2各组大鼠肾脏组织病理学改变

治疗8周后PAS染色对照组肾小球未见病理改变。糖尿病组痛小球基底膜增厚，ECM增多，系膜区扩大。治疗组ECM增多及系膜区扩张较糖尿病组明显减轻。达较糖尿病组弱。

3.讨论

本实验通过采用高糖高脂饮食配合STZ诱导的方法来制备类似糖尿病的动物模型。在本实验中我们观察到给药前大鼠具有高血糖、各大胰岛素水平接近于正常且伴有胰岛素敏感性降低等特点，来证实糖尿病动物模型的制备成功。给药8周后，模型组动物均不同程度出现肾脏肥大，Scr增加，伴微量白蛋白尿，常规病理切片显示肾小球基底膜增厚、系膜基质扩张，ECM积聚，表明模型动物组已处于DN的早期阶段。

TGF—β是一族具有广泛生物学活性的多肽，生物学功能复杂，如调节细胞增殖和分化，参与炎症反应、组织修复、胚胎发育和免疫调节靠墙客，并能刺激ECM的产生，导致组织纤维化。TGF—β可诱导多种细胞分泌CTGF，反过来，CTGF双可作用于相关细胞，参与TGF—β对这些细胞的促增生和ECM合成作用[6]。该现象提示人们，CTGF可能是TGF—β发挥生物学效应的下游因子。Riser等[7]研究发现单独应用重组人CTGF可以诱导正常大鼠肾系膜细胞增生并大量合成纤维连接蛋白，在db/db糖尿病小鼠动物模型中，小鼠的糖尿病早期即仅有轻度系膜增生、蛋白尿和间质改变时，就可检测到系膜我CTGFmRNA明显增加。Ito等[9]利用人的肾活检标本，利用原位杂交方法观察到，在人类以细胞增生和基质沉积为主的肾小球疾病如新月体性肾小球肾炎，IgA肾病及糖尿病涌小球石化症等，CTGFmRNA的细胞数增加，以肾小管上皮细胞为主，并与损害的程度相关联。这表明CTGF作为TGF—β促纤维化活性的下游效应因子在病理状态下过度表达可能是脏病变区域基质沉积和进行性肾小球石化的重要原因之一。

本实验的结果显示，2型糖尿病大鼠肾脏组织中存在CTGF表达增强的病理改变，用塞来昔布治疗后，肾组织中CTGF表达增强的病理改变，用塞来昔布治疗后，肾组织中CTGF表达减少，大鼠肾重/体重、细胞外基质相对面积均明显降低，肾ECM减少，纤维化程度头像，肾脏病理结构改变好转。一些生化指标明显好转，且具有统计学差异。

塞来昔布作为新一代选择性COX-2抑制剂，能够专一地阻断COX-2活性，减少病理性前弄腺素如PGE2前列环素（PGI2血栓烷素A2（TXA2）的合成，改善肾脏血流动力学异常[10]，减少尿蛋白，同时保留COX-1的正常生理活性，此外，选择性COX-2抑制剂还能够通过对胰岛β细胞的保护来降低高血糖水平[11]。由于近来研究发现高糖可以诱导系膜细胞表达CTGFmRNA[12]，因而塞来昔布不仅可以直接抑制CTGF表达，还能通过降低高血糖水平来抑制系膜细胞表达CTGFmRNA，从而抑制的过度能起着重要的作用，塞来昔布对2型DM大鼠肾脏的保护作用至少部分是通过下调CTGF的表达，抑制ECM的过度沉积来实现的。

综上所述，塞来昔布在DN中的治疗应强调早期、低剂量使用，并禁用于肾功能严重受损情况下，其肾脏保护机理部分是通过抑制NF-κB的表达、减轻肾组织中单核/巨噬细胞的浸润来实现的。

参考文献

[1]罗冬冬，刘必成，张晓良，等.伊贝沙坦糖尿病大鼠结缔组织生长因子表达的影响。中国药科大学学报，2002，（4）：326-330.

[2]李华，贾汝汉.莫比可对2型糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究。中国医师杂志，2004，22（6）777-779.

[3]李华，贾汝汉，邱昌建.环加氧酶在2型糖尿病大鼠肾脏中的表达及意义.实用医学杂志，2004，20（5）：368-370

[4]陈健，贾汝汉，余堂宏.塞来昔布对2型糖尿病大鼠肾脏保护作用机理的..时珍国医国药，2004，25（9）：550-552.

[5]陈健，贾汝汉选择性环氧化酶2抑制剂在糖尿病肾病中的研究进展.临床肾脏病杂志，2004,4(5):236-238.

[6]ChenMM,LamA,AbrahamJA,etal.CTGFexpressionisinducedbyTGF-betaincardiacfibroblastsandcardiacmyocytes:apotentialroleinheartfibrosis.JMolCellCardion,2000,32(10):1805-1819.

[7]RiserBL,DenichiloM,CortesP,etal.Regulationofconnec-tivetissuegrowthfactoractivityinculturedratmesangialcellsandistexpressioninexperimentaldiabeticglomeru-loselerosis.JAmSocNephrol,2000,11(1):25-38.

[8]ItoY,AtenJ,BendeRJ,etal.Expressionofconnectivetis-suegrowthfactorinhumanrenalfibrosis.KidneyInt,1998,53(4):853-861.

[9]KomersR,LindsleyJN,OyamaT,etal.Immunohistoche-micalandfunctionalcorrelationsofrenalcyclooxygenese-2inexperimentaldiabetes.JClinInvest,2001,107(7):889-898.

[10]崔世维.非甾体消炎药治疗肾小球疾病的研究现状.中国中西医结合肾病杂志，2002，3(6):372-374.

[11]TabatabaieT,WaldonAM,JacobJM,etal.COX-2inhibitionpreventsinsulin-dependentdiabetesinlow-dosestreptozotocin-treatedmice.BiochemBiophysResCommun,2000,273(2):699-704.

[12]刘芳,黄颂敏中,刘小菁,等.高糖及血管紧张素Ⅱ对大鼠