苦豆子提取物体外抗肿瘤及抗紫外线辐射作用的研究

苦豆子提取物体外抗肿瘤及抗紫外线辐射作用的研究

栾迎春王兵张秀丽

栾迎春王兵张秀丽（河南濮阳中原油田总医院烧伤整形美容科河南濮阳457001）

【中图分类号】R64【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）1-0218-03

【摘要】目的探讨苦豆子提取物的抗肿瘤及抗紫外线辐射作用。方法采用MTT分析法检测苦豆子水提物及醇提物对人肝癌细胞株Bel-7402及小鼠B16黑色素瘤细胞株的体外抑制作用，采用紫外线照射后的小鼠成纤维细胞株L929细胞，检测此两部分对细胞的保护作用。结果苦豆子醇提物及水提物对肿瘤细胞均具有抑制作用，与正常对照比，有显著性差异（P＜0.01）；在紫外线损伤过程中，苦豆子醇提物及水提物在低浓度0.063mg/ml、0.125mg/ml时对L929细胞出现明显的保护作用，与未加药的紫外对照组比，有显著性差异（P＜0.01）；紫外线损伤后，苦豆子醇提物在低浓度0.063mg/ml时对L929细胞出现明显的保护作用，与未加药的紫外对照组比，有显著性差异（P＜0.01）。结论苦豆子醇提物及水提物体外具有抗皮肤肿瘤及抗紫外线辐射作用。

【关键词】苦豆子提取分离MTT分析法紫外线

苦豆子（SophoraalopecuroidesL.）是豆科槐属植物，属多年生草本植物，广泛分布于我国新疆、甘肃、青海、宁夏、内蒙古等西部省区，味苦性寒，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫、平喘止咳等作用[1]。临床用于治疗痢疾、疮疖、外伤化脓、湿疹、顽癣、滴虫及胃病等各种疾病，近年来研究发现，具有抗癌作用[2、3、4、5、、6、7]，如全身用药治疗恶性葡萄胎、抗小鼠淋巴瘤及乳腺癌作用[8]、对人红白血病细胞株K562、肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用等[9]，但目前还未发现苦豆子对皮肤肿瘤及抗紫外线方面的系统报道。故本试验采用MTT分析法对苦豆子体外抗皮肤肿瘤及抗紫外线辐射的作用进行探讨。

1材料及方法

1.1药物苦豆子（购自药店，由我院中草药专家鉴定），采用传统方法分别用去离子水和95%乙醇反复提取，得到水提物和醇提物，4℃冰箱保存待用；顺铂(山东齐鲁制药厂，批号：20060104)。

1.2肿瘤细胞株人肝癌细胞株Bel-7402；小鼠B16黑色素瘤细胞株；小鼠成纤维细胞株L929（以上细胞株均购自协和医科大学细胞库）。

1.3试剂、主要仪器MTT(Sigma公司，批号：20060102)；胰蛋白酶(Merck公司，批号：20060220)；96孔板(Costar公司)；0.22um的滤器(Pall公司)；胎牛血清(河北汇丰生物技术研究所)；所用其它试剂均为分析纯（北京化工厂）；XSP-D型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）；BMGPOLARSTAR-OPTIMA多功能酶标仪（德国）；TC2323型CO2细胞培养箱（美国SHELLAB公司）；TS-1型脱色摇床（江苏医用仪器厂）；超静工作台（北京昌平空气净化公司）。

1.4方法

1.4.1对Bel-7402及B16细胞株的体外抑制作用参照文献[10]，常规培养细胞，待细胞进入对数生长期后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，然后用含10%小牛血清RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100uL，用10%小牛血清RPMI1640按2mg/mL的浓度稀释提取物，微孔滤膜过滤后每孔加入100uL，初浓度为2mg/mL，对倍稀释四个浓度，终浓度为0.25mg/mL,顺铂根据其IC50值计算，设置浓度为62.5ug/mL作为阳性对照,各浓度均设6个复孔,并设空白对照和细胞对照。置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h，培养结束前4h，各孔加入MTT（5mg/mL）10uL，培养结束后，每孔弃去100uL培养基原液，加入10%的SDS-0.01NHCL100uL，脱色摇床震荡10min后放置过夜，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度值，空白调零，并计算抑制率。其计算公式为：抑制率=（对照组吸光度值—试验组吸光度值）/对照组吸光度值×100%。

1.4.2对紫外线损伤过程中的L929细胞的保护作用参照文献[11]，常规培养L929细胞，待细胞进入对数生长期后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，然后用含10%小牛血清RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×106/mL，接种于96孔培养板，每孔100uL，用10%小牛血清RPMI1640按0.5mg/mL的浓度稀释提取物，微孔滤膜过滤后每孔加入100uL，初浓度为0.5mg/mL，对倍稀释四个浓度，终浓度为0.063mg/mL,每浓度6复孔，并设细胞对照组、未加药紫外对照组，孵育12小时。用辐射强度为2×10-3J/cm2的紫外线照射，细胞对照组不经照射。然后各孔加入MTT（5mg/mL）10uL，继续培养4小时，加入10%的SDS-0.01NHCL100uL，脱色摇床震荡10min后放置过夜，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度值。

1.4.3对紫外线损伤后的L929细胞的保护作用L929细胞经辐射强度为2×10-3J/cm2的紫外照射后，加入提取物培养12小时。加入MTT和裂解液，检测在570nm处的吸光度值。细胞浓度、药物浓度及其它设置与损伤过程中条件相同。

1.5统计学处理：结果用X±S表示；显著性检验采用方差分析；两两比较用Dunnet-t检验。

2结果

2.1苦豆子提取物对Bel-7402、B16细胞株的体外抑制作用（见表1）。

表1.苦豆子提取物对7402、B16细胞的体外抑制作用

注：*与正常对照组比较，P＜0.01。

从表1可见，与正常对照比苦豆子乙醇提取物及水提物对Bel-7402细胞株、B16细胞株有明显的体外抑制作用；从0.25mg/ml至2mg/ml均对这两株细胞有抑制作用（P＜0.01），高浓度2mg/ml的抑制率与阳性对照顺铂活性相当。

2.2苦豆子提取物对紫外线损伤L929细胞的保护作用（见表2）。

表2.苦豆子提取物对紫外线损伤L929细胞的保护作用

注：#与正常对照组比较P＜0.01,*与紫外对照组比较P＜0.05,**P＜0.01

由表2可见，与紫外对照组比，损伤过程中，苦豆子醇提物及水提物在低浓度0.063mg/ml、0.125mg/ml时出现明显的细胞保护作用（P＜0.01），高浓度醇提物0.5mg/ml出现明显的细胞抑制作用（P＜0.01）；损伤后，苦豆子醇提物在低浓度0.063mg/ml出现明显的细胞保护作用（P＜0.01），高浓度醇提物0.5mg/ml、0.25mg/ml出现明显的细胞抑制作用（P＜0.05），高浓度水提物0.5mg/ml出现细胞抑制作用（P＜0.05）；此结果同时提示，苦豆子提取物具有细胞毒作用，如考察抗紫外线辐射作用应选择浓度低于0.125mg/ml。因紫外线损伤前和损伤后的L929细胞非平行试验，故不作比较。

3讨论

我们用传统方法将苦豆子分为乙醇部分及水溶部分，用MTT分析法考察了这两部分体外对瘤细胞的抑制作用，苦豆子乙醇提取物及水提物从0.25mg/ml至2mg/ml均对人肝癌细胞株7402、小鼠B16黑色素瘤细胞株有抑制作用，此结果与相关文献[12、13]所报道的苦豆子的体外抗肿瘤作用相符，并为其抗瘤谱增加了新的内容。高浓度2mg/ml的抑制率与阳性对照顺铂活性相当，分析后推断可能由于浓度过高对细胞产生毒性导致细胞死亡，建议从天然产物得到的有效部位体外实验，浓度应控制在1mg/ml以下。在此基础上，用强度2×10-3J/cm2的紫外线照射L929细胞，观察苦豆子醇提物及水提物在细胞损伤过程中及损伤后细胞的变化，苦豆子醇提物及水提物对损伤过程中的细胞有保护作用，但水提物对损伤后的细胞没有恢复作用；可以推断苦豆子水提物不能修复紫外线对细胞DNA造成的损伤，此试验对苦豆子提取物的体外抗紫外线作用作了新的探索。有望对苦豆子抗皮肤肿瘤及抗紫外线辐射作用的活性物质进一步跟踪分离，寻找苦豆子中新活性、新结构化合物进行构效关系的研究，并加强动物移植性肿瘤模型、人癌裸鼠移植模型等体内试验，应用肿瘤相关基因表达谱芯片技术等，确认其活性，明确作用机制，为最终应用于临床作出前期工作。

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