液相色谱限制性填料在临床药物分析中的应用

液相色谱限制性填料在临床药物分析中的应用

万顺之

万顺之（江苏正大天晴药业股份有限公司222062）

【摘要】目的：探讨液相色谱限制性填料在临床药物分析中的应用。方法：从限制性填料的萃取剂分离机制、RAM填料单柱系统及柱切换系统在体内药物分析中应用和RAM填料的新应用三个方面进行分析。结果：简要介绍了限制性填料固相萃取原理及分类，并对该技术在临床药物分析及药代动力学领域中的应用现状及发展趋势作了详细的综述。结论：限制性填料属于特殊萃取介质之一，允许复杂生物基质样品直接进样分析，结合液相色谱系统可以实现生物样品自动化直接进样，简化并加速了样品预处理过程。

【关键词】液相色谱限进介质直接进样样品前处理

【中图分类号】R927【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）06-0268-02

传统液相色谱填料无法实现对复杂生物基质混合体系(如血清或血浆)直接进样分析。蛋白沉淀法样品预处理过程选择性较低，存在未沉淀完全的内源性生物基质残留于提取液中，同时对部分待测物会同蛋白沉淀物发生共沉淀，而导致检测信号衰减。专属性强、选择性高的萃取填料的发展，允许生物基质直接多次进样，以降低样品预处理时间。在这些填料中，限制性介质（RAM）被认为是目前最流行的萃取材料之一。

1限制性介质萃取分离机制及分类

RAM包括一个填料家族通过限制大分子物质同填料颗粒核心的相互作用，只允许小分子进入填料核心。大分子物质仅能同填料外表面亲水集团相互作用，减少了基质蛋白的变性吸附。根据填料核心直径的物理屏障或蛋白质及聚合物在填料表面形成的化学扩散屏障，大分子物质可以被洗脱，待测物则通过疏水作用和静电作用保留。按蛋白排阻机制。RAM填料分为：内表面反相填料烷基二醇硅胶填料，键合相多孔硅胶填料，半渗透表面填料，蛋白涂渍硅胶填料，混合功能填料，屏蔽憎水相填料。RAM填料制备的色谱柱直接连接检测器或者在柱切换系统中作为预柱，能够实现自动化并加速样品预处理过程。近几年，这种在线样品萃取技术被广泛应用于在体内药物大规模快速分析中。

2RAM填料单柱系统及柱切换系统在体内药物分析中应用

2.1单柱系统单柱系统中RAM柱作为萃取柱同时兼有分离作用。RAM柱富集待测组分的同时完成其色谱分离。Huclova等将ADS柱集成连续进样分析系统使用荧光检测器直接测定血清中利尿药呋塞米浓度。该RAM连续进样系统实现了生物样品在线直接自动化进样。整个分析过程包括样品预处理、分析检测及柱平衡，共需20min。血清中呋塞米回收率为101.4％～103.4％。马骏等使用混合功能填料RAM单柱首次测定了人血浆中抗肿瘤药10-羟基喜树碱羧酸型和内酯型浓度，由于不需要对样品进行预处理，故缩短了生物样品单次分析时间及所需样品量。还同时用直接进样高效液相色谱法及荧光偏振免疫法测定人血浆中抗癫痫药卡马西平浓度，结果显示对于人血浆中卡马西平浓度的测定两种方法存在较好相关性。该研究为RAM色谱法开展临床药物血药浓度监测提供了依据。

2.2柱切换系统柱切换系统中RAM柱作为萃取柱，对待测组分起到萃取富集作用。RAM柱后接分析柱，对待测组分进行色谱分离并分析。

Baeyens等成功地在柱切换系统中使用烷基二醇硅胶填充的限进预柱测定了马血浆中酮洛芬两种对映体浓度。进样体积为80uL至500uL，取得在20min内分离酮洛芬的效果。

3RAM填料的新应用

3.1限进填料制备固相微萃取纤维系统用管内固相微萃取RAM毛细管柱测定了血清中药物浓度。使用阳离子交换限进填料制备固相微萃取纤维液相色谱法，测定了全血中血管紧张素I含量。离子交换二醇硅胶较传统烷基二醇硅胶其对多肽类物质有较强萃取富集效率，其外表面键合二醇基团，内表面键合的磺酸基团部分对低相对分子质量化合物具有较强阳离子交换作用。

3.2搅拌棒吸附提取用限进材料作为搅拌棒吸附提取技术中的吸附涂层，对体液中咖啡因及其代谢产物进行了直接萃取分析，用ADS材料作为SBSE涂层，能够清除生物样品中蛋白同时直接提取咖啡因及其代谢产物，克服了血浆样品直接进样导致蛋白污染沉积于萃取涂层对分析的影响。传统SBSE技术在玻璃棒表面涂布一层聚二甲基硅氧烷以实现对水性介质中有机化合物的提取，由于其对基质蛋白吸附较强，对极性化合物灵敏度较低，故其分析生物样品时回收率较低，仅为50％～80％。RAM-SESE优势在于其允许直接进样，简化样品预处理过程，提高了回收率，约为89％～103％。

4结论

采用限进介质固相萃取技术可有效解决生物样品测定时基质中蛋白质、核酸等大分子物质干扰，并同时实现对小分子分析物萃取富集。将该样品前处理技术与液相色谱在线联用，可实现对生物体液等复杂样品直接进样分析。RAM色谱法方便快速，萃取效率、灵敏度及选择性较高。RAM柱切换模式的通用性使其对不同基质中各种化合物的分析有较理想表现，目前不同功能属性、不同种类RAM萃取预柱正日渐商业化。RAM填料在生物样品分析方面应用日益广泛，基于不同分离模式及化学性质并结合LC-UV、LC-MS方法的新型填料的出现必将为在线提取分离技术带来新的机遇。

目前，新的提取分离技术尤其是各种色谱技术已广泛应用于天然药物的有效成分研究，但很多色谱分离、分析模式都是基于混合物间理化性质的差异，并未包含任何药理功能的信息。AFC是根据生命现象中生物大分子间高亲和力与高专一性可逆结合而设计的一种独特的色谱分离方法。在亲和色谱中，将能与潜在药物(配体)特异结合的物质(配基)，如靶蛋白等固定于色谱填料上制备色谱柱，再将待分离混合物与色谱柱固定相一起孵育后，以洗脱液洗脱或不经孵育，使混合物缓慢、连续地通过色谱柱，即可实现混合物间以亲和性为基础的分离。亲和色谱一般使用生物来源的配基，但随着其应用范围的扩大，一些非生物来源的配基也逐渐被采用。

参考文献

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