原发膜性肾病尿液蛋白质组学初步研究

原发膜性肾病尿液蛋白质组学初步研究

陶倩如1赵久阳2

陶倩如1赵久阳2

（1常州市第一人民医院肾内科213000；2大连医科大学附属第二医院肾内科116000）

【摘要】目的期望寻找出膜性肾病的生物学标记物。方法本实验采用HPLC-ESI-MS/MS技术研究原发膜性肾病的尿液蛋白质谱特点，并与健康人尿蛋白谱进行比较，筛选出膜性肾病中差异表达的蛋白质。结果与正常人的比较，找出8种差异蛋白。结论血浆铜蓝蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、α-1B糖蛋白、维生素D结合蛋白、钙结合蛋白39有可能成为膜性肾病的生物标记物。

【关键词】蛋白质组学原发性膜性肾病尿蛋白生物标记物

【中图分类号】R586【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）20-0014-02

一、资料与方法

（一）资料

留取2009.6～2010.1在大连医科大学附属第二医院的肾内科住院肾活检后确诊为原发膜性肾病患者（n=9）的清晨中段尿，该9例患者24小时尿蛋白定量均大于1克，取尿液标本前至少1个月未服用特殊药物，肾活检病理结果显示为原发性膜性肾病且无高血压、糖尿病肾病病理改变。留取无肾脏疾病也无其他系统的健康对照者(n=3)的清晨中段尿。全部标本采取时均获得患者的“知情同意”，符合伦理学原则。

（二）方法

1.尿液的收集：用无菌瓶留取空腹清洁中段晨尿50ml，将留取的新鲜晨尿标本保存在冰块中，为避免细菌生长和蛋白酶解于1小时内放置于－80℃冰箱保存备用。

2.蛋白的提取：取出12份标本溶解完全后，每份标本取3ml,用直径为0.22μm的微孔超滤膜过滤除去细胞碎片等较大的杂质，再用－20℃预冷丙酮按照标本体积与丙酮体积比为4：1的比例迅速加入进行蛋白沉淀，置于－20℃冰箱过夜后，经4℃4000×g离心20分钟，弃上清液，留取含尿蛋白的沉淀物，于真空干燥浓缩。

3.尿蛋白浓度测定：每管取1mg浓缩干燥的蛋白沉淀物用PBS充分溶解后应用Bradford法测定蛋白浓度（考马斯亮蓝染色）[3]。先将BSA标准蛋白稀释成不同的浓度，加入考马斯亮蓝G-250蛋白定量试剂（100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1L，用滤纸过滤），反应5分钟后，在紫外分光光度仪595nm处测定吸光光度值，绘出标准曲线。在待测标本中加入考马斯亮蓝G-250蛋白定量试剂同法测定，根据标准曲线计算出待测标本的蛋白浓度。

4.尿蛋白酶解：据测定的标本浓度称取每例样品各1mg蛋白质的混合固体备用。配制100ML的100mMNH4HCO3(MW79.06)调整PH8.0，配制8M尿素（MW60.06），配酶液，进行酶解。取1mg蛋白，加入8M尿素56℃反应10分钟，再加入20μl100mMDTT,56℃反应1小时，加入20μl200mMIAA，37℃避光震荡反应30分钟，再加入810μl100mMNH4HCO3（PH8.0），每瓶加25μl1mg/mlTypsin37℃避光反应12小时后再加入25μl1mg/mlTypsin,加甲酸按体积比1：100酸化。

5.行HPLC-ESI-MS/MS：配制A液：98%纯水+2%乙腈+0.1%甲酸，共500ML。B液：98%乙腈+2%纯水+0.1%甲酸，共500ML，分别置于超声仪除尽气泡。采用本实验室自行填装的色谱柱，用微量注射器取每份样品20μl为上样量，每份样品重复两次，梯度洗脱时间程序：0→20min→160min→160.1min→180min,0%B→10%B→40%B→80%B→80%B；流速：5μl/min；分析时间为：180分钟；扫描范围：m/z400～2000；喷雾电压：1.8kv；加热毛细管温度：150℃。

6.质谱分析数据搜库：所有串联质谱结果采用MASCOT软件行数据库检索，所用的库为ipi.human,v3.05。MASCOT中主要的参数设置有：种属：Allentries；酶：Trypsin；可变修饰：Oxidation；固定修饰：Cabamidomethyl；MS质量容忍差异2Da；MS/MS质量容忍差异1Da。

获得混合肽片段质量数据在Uniprot（http://www.Uniprot.org）数据库中进行检索，查询所表达的蛋白质名称、靶基因等相关信息。

二、结果

1.经过对12份尿液蛋白分析得到的基峰色谱图

2.应用MASCOT软件检索InternationalProteinIndex(IPI)human数据库中检索12份尿液的肽序列，其中正常人3份标本中共鉴定出101种蛋白质，通过手工验证，所有3份标本共同表达了37种蛋白质。他们分别是角蛋白，Ⅱ型细胞骨架1、尿调节素、角蛋白，Ⅰ型细胞骨架10、CD44抗原、细胞外硫代硫酸酯酶2、AMBP蛋白、α-1酸性糖蛋白、CD59糖蛋白、WAPfour-disulfidecoredomainprotein2、32KDaprotein、骨桥蛋白、胰腺α淀粉酶、胰酶-1、非分泌性核糖核酸酶、嗜铬粒蛋白A、锌α2糖蛋白、HomoboxproteinHox-B3、泛素结合酶E2O、mJERFdomain-containingprotein3,mitochondrial、Dermcidin、WDrepeat-containingprotein59、激肽原-1、胰岛素样生长因子结合蛋白7、IGKV1-5protein、激活前体多肽、激肽释放酶-1、表皮生长因子、胶原α-1链、丛生蛋白、PutativeuncharacterizedDKFZp686k03196、Trefoilfactor2、PtoteinYIPF3、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1、半凝乳素3结合蛋白、Ly-6neurotoxin-likeprotein1、Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4。膜性肾病患者的9份尿液标本共检测到174种蛋白质，所有9份标本共同表达了20种蛋白质。膜性肾病共同表达的20种蛋白质分别为血浆白蛋白、转铁蛋白、蛋白质磷酸酶1调节亚基1A、锌-α2糖蛋白、α-1酸性糖蛋白、载脂蛋白D、免疫球蛋白重链、α-1B糖蛋白、前列腺素-H2D-异构酶、α-1酸糖蛋白2、补体C4A、泛素结合蛋白酶E2O、血浆铜蓝蛋白、IPI00745619（未知蛋白）、Igλ链、P1011（未知蛋白）、维生素D结合蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、对ATP敏感的内向整流钾离子通道11、钙结合蛋白39。

以上20种蛋白质中，手工剔除正常人尿液中也存在的蛋白，还剩余8种蛋白质，他们分别是血浆铜蓝蛋白、Igλ链C区、α-1B糖蛋白、维生素D结合蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、对ATP敏感的内向整流钾离子通道受体11、钙结合蛋白39、IPI00745619（未知蛋白）。

三、讨论

本实验采用HPLC-ESI-MS/MS的方法成功分析出了膜性肾病和健康人尿蛋白多肽序列质谱图，经过鉴定膜性肾病得到174种蛋白质，与正常人的比较，找出8种差异蛋白，这8种蛋白其中有1种为未知蛋白，其中7种蛋白质功能如下：

血浆铜蓝蛋白存在于在所有脊椎动物血清中并携带了95%以上血清铜的α2糖蛋白唾液酸酶，主要在肝脏中合成。该蛋白是一种应急反应蛋白，当生物体发生感染、炎症或损伤时，诱发了肝脏内铜蓝蛋白基因的大量表达致使血清铜蓝蛋白浓度升高。铜蓝蛋白在血浆中的含量大概为300pg/ml，拥有有多种生物活性，比如铜离子运输，血管生成，血液凝固，铁平衡，铁转运以及抗氧化作用等。并且有三种酶活性:胺氧化酶，SOD，以及亚铁氧化酶。由于铜蓝蛋白是一种应急蛋白，在动物体或人体发生病变或受到伤害的时候，它在血浆中的浓度会随之而发生改变，因此，除了以上功能外，铜蓝蛋白在医学上还被视为许多疾病的标志性蛋白，在疾病诊断中发挥着重要作用。

富含亮氨酸的α2糖蛋白和α-1B糖蛋白是分泌蛋白,具有促进脂肪细胞质代谢作用。脂类因素能够影响肾脏疾病的进程及对激素治疗的反应。至于他们在尿液中的浓度变化以及在肾病中起何种作用需作进一步研究。

维生素D结合蛋白是一种α球蛋白，是一组包括白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、甲胎蛋白(AFP)在内的多基因超家族，大多数是由肝脏实质细胞分泌的相对分子质量约55000的蛋白质，在血清中含量丰富，具有多项生理功能。它不仅结合维生素D和清除肌动蛋白，还增强C5对中性粒细胞等炎症细胞的趋化活性，并且激活巨噬细胞。调节破骨细胞活性及运输脂肪酸和内毒素，还可能参与病毒感染。

钙结合蛋白39（又称MO25）参与LKB1∶STRAD∶MO25复合体,可以变构或磷酸化AMPK（5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶）α亚基上的苏氨酸72而激活AMPK[28]，AMPK是细胞能量的感受器,具有开启、关闭和调节能量代谢的“阀门”作用。在其作用下,糖酵解加强,肝脏糖异生减少,葡萄糖转运蛋白的表达和转位增强,细胞对葡萄糖摄取增加;脂肪酸氧化增强,脂肪合成抑制;在呼吸链中,AMPK可上调线粒体解耦联蛋白3(UCP3)和一些线粒体氧化酶的表达,促进ATP的生成。此外,AMPK还与激素、细胞因子协调作用,对下丘脑的摄食中枢和外周组织(脂肪组织、骨骼肌等)进行调节,在整体水平上调控能量的摄入和消耗。

Igλ链C区是免疫球蛋白分泌片段，参与机体的免疫应答反应。

对ATP敏感的内向整流钾离子通道受体11，是一种膜蛋白，该受体被G蛋白控制，该通道使得钾离子更倾向于内流，他们的电压依赖被细胞外的钾离子浓度所调节，当细胞外的钾离子浓度上升时，通道打开，钾离子内流。

血浆铜蓝蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、α-1B糖蛋白、维生素D结合蛋白、钙结合蛋白39都与免疫应答、氧化应激脂肪代谢有关，因此有可能成为膜性肾病的生物学标记，但是检测出来的蛋白还需要进行进一步验证，以及它们与膜性肾病发生发展的关系以及在病理生理学机制方面的作用还有待研究。

四、结论

1.采用HPLC-ESI-MS/MS质谱分析的方法鉴定了原发性膜性肾病尿液蛋白质，成功的获得了该疾病的多肽序列质谱图，最终得到174个蛋白质。

2.其中血浆铜蓝蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、α-1B糖蛋白、维生素D结合蛋白、钙结合蛋白39有可能成为疾病的生物标记物。

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