中药材鬼箭羽主成分槲皮素、山柰素含量测定方法学研究

中药材鬼箭羽主成分槲皮素、山柰素含量测定方法学研究

支荣荣

支荣荣

（江苏省盐城市药品检验所224002）

【摘要】为《江苏省中药材标准》（1989年版）修订。研究中药材鬼箭羽主成分槲皮素、山柰素HPLC测定方法，以供标准修订参考。

【关键词】鬼箭羽槲皮素山柰素含量测定方法学

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）23-0373-02

本品为卫矛科植物卫矛Euonymusalatus（Thunb.）Sieb.的干燥木栓翅，因其枝条上生栓翅如箭羽，且甚怪异，故称“鬼箭羽”。李时珍[1]说：“鬼箭生山石间，小株成丛。春长嫩条，条上四面有羽如箭羽，视之若三羽尔。”现今有关文献记载的药用部位为带翅状物的枝条或翅状附属物[2]，本省实际使用情况为木栓翅，为江苏省地方中药材。本品含木栓酮、β-谷甾醇、卫矛醇、槲皮素、槲皮素-3-半乳糖、槲皮素-3-半乳糖-本糖等[3、4]。该品种收载于《江苏省中药材标准》（1989年版），由于该标准执行时间较久，已不能全面地控制鬼箭羽的质量，为完善该标准，研究了主成分槲皮素、山柰素HPLC测定方法，供该标准修订参考。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；BP211D电子天平（德国Sartorius）；BT224S电子天平（德国Sartorius）。

1.2试药槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：10081-200907）；山柰素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110861-200808）甲醇、乙腈（江苏汉邦科技有限公司，色谱纯）；水（超纯水）等；其它试剂均为分析纯。鬼箭羽样品为10批次，采、购自江苏各地。

2实验方法与结果

2.1对照品溶液的制备以甲醇制备槲皮素、山柰素的混合对照品溶液（槲皮素5μg/ml、山柰素10μg/ml）。

2.2供试品溶液的制备

取本品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液(4：1)混合溶液50ml，密塞，称定重量，置90℃水浴中回流1小时，立即冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，用0.45μm滤膜过滤，测定。

2.3色谱条件色谱柱为CapcellC18柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(47：53)；检测波长为360nm，柱温为30℃；流速为1.0ml/mlm；进样量均为10μl。（图1）

图1含量测定高效液相色谱图

A对照品溶液，B供试品溶液，C空白溶剂

2.4线性关系考察照《中国药典》2010年版(一部)附录ⅩⅧA中药质量标准分析方法验证指导原则试验，结果表明：槲皮素对照品溶液浓度在1.434～19.12μg/ml范围内呈现良好的线性关系；山柰素对照品溶液浓度在3.138～41.84μg/ml范围内呈现良好的线性关系。

2.5精密度试验精密吸取对照品溶液（槲皮素5μg/ml、山柰素10μg/ml），连续进样6次，对照品溶液峰面积的RSD为0.2%，结果表明精密度良好。

2.6稳定性考察取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8h分别进样10μl，按上述条件测定峰面积，RSD为0.5%（n=5)，结果表明供试品溶液在8h内稳定。

2.7重复性试验精密称取同一样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份，依次测定，计算得含量，RSD为1.3%，结果表明重复性良好。

2.8加样回收率试验精密称取已知含量的样品（槲皮素、山柰素总量1.05mg/g）0.5g，六份，分别精密吸取每ml含95.6μg槲皮素的对照品溶液1.1ml（其中含槲皮素0.1052mg），精密吸取每ml含104.6μg山柰素的对照品溶液（对照品溶液-1）4.0ml（其中含槲皮素0.4184mg），依法制得供试品溶液。分别吸取上述溶液各10μl测定，计算回收率，槲皮素加样回收率为98.6％，RSD为0.5％（n＝5）；山柰素加样回收率为98.8％，RSD为0.3％（n＝5）。

2.9样品测定及限度拟定依法测定样品10批，按干燥品计算，槲皮素（C15H10O7）和山柰素（C15H10O6）的总量平均值为0.11％，以平均值80％设限，为0.088%，故规定本品干燥品计算，含槲皮素（C15H10O7）与山柰素（C15H10O6）的总量不得少于0.090％。

3讨论

3.1供试品溶液提取条件的考察

3.1.1参考金钱草[1]槲皮素的提取方法：取本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液(4：1)混合溶液50ml，密塞，称定重量，置90℃水浴中回流1小时，立即冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，用0.45μm滤膜过滤，即得

3.1.2参考了银杏叶[1]槲皮素的提取方法：取本品0.5g,精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2小时，弃去三氯甲烷液，药渣再加甲醇回流提取，提取液蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液25ml，回流后，加甲醇定容至50ml，即得。

3.1.3参考了地锦草[1]中槲皮素的提取方法：取本品粉末（过三号筛）约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀.滤过，精密量取续滤液20ml，精密加入25%盐酸溶液7ml，置85℃水浴中水解30分钟，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果表明，三种方法含量接近，考虑到方法简便易行，选择方法3.1.1作为检测方法。我们也比较了不同浓度的盐酸溶液（15%盐酸、25%盐酸、35%盐酸）、不同水解时间（30min、60min、90min、），不同水解温度（85℃、90℃、95℃）的变化，对含量测定的结果进行了比较，结果显示25%盐酸90℃水解1小时的方法最合理。

3.2稳定性考察中遇到的问题。在筛选检测方法的同时，我们对样品进行了稳定性考察，发现了样品不稳定的问题，即样品中槲皮素、山柰素峰面积衰减明显（约过滤后2小时开始），3.1中提到的几种提取方法，均不稳定。更换所有试剂的品牌，仍然不稳定。同时，以对照品做比对，将对照品按照供试品溶液的配制方法稀释，结果对照品是稳定的，24小时内未发生峰面积减小。

最后，在试验中偶然发现，按照3.1.1方法，剩余的未过滤部分的供试品溶液（约18小时后，未对它进行冷藏或者避光处理）再用滤纸过滤后立即检测，峰面积与18小时前接近（衰减了约10%），而此时，用滤纸过滤后的同一样品中，槲皮素、山柰素的含量已很低。于是，我们认为可能是滤纸过滤有影响，随后，我们选择了离心法替代滤纸过滤，进行了稳定性考察，结果稳定性良好，槲皮素峰面积在8h内稳定，RSD%为1.5%。因此采用了离心代替滤纸过滤。

参考文献

[1]林启寿.中草药成分化学[M].北京:科学出版社,1977,554

[2]国家药典委员会，中国药典（一部），中国医药科技出版社，2010:223、543、201