侯崇强(明治医药<山东>有限公司山东济宁272100)
【摘要】螺旋霉素生产过程中,反萃取温度和pH等参数对螺旋霉素成品中Ⅱ、Ⅲ组分含量的影响,在反萃取工序做了大量试验,特别是对反萃取的不同反萃取温度、反萃取最佳pH值等方面做了大量对照试验,总结出一些提高SPM成品Ⅱ、Ⅲ组分含量的工艺改进方法,为以后提高SPM成品质量的研究提供了试验数据和理论基础。
【关键词】螺旋霉素萃取反萃取组分缓冲液
【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)17-0369-02
螺旋霉素(spiramycinSPM)是由生二素链霉菌(S.ambofaciens)产生的多组分的十六元大环内酯类抗生素,其内酯环的生物合成由5分子乙酸、1分子丙酸、1分子丁酸和1分子未知前体(二碳单位)组成,支链氨基酸如缬氨酸等,经分解代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸,作为SPM生物合成的前体,由于3-位的基团不同,有三个主要成分,分别是Ⅰ(3-OH),Ⅱ(3-O-乙酰基),Ⅲ(3-O-丙酰基),见下图:
Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组分的分子量分别是842,884,898,成品中各组分分别占:Ⅰ:5-10%,Ⅱ,20-30%,Ⅲ:50-60%。由于螺旋霉素组分Ⅰ3-位是一个羟基,乙酰化后与组分Ⅱ相同,所以乙酰螺旋霉素只有组分Ⅱ,分子式为C47H78O16N2,分子量为927.14,组分Ⅲ,分子式为C48H80O16N2,分子量为941.16。因此,提高SPM成品中Ⅱ、Ⅲ组分含量,对提高SPM的成品效价,提高乙酰收率和乙酰螺旋霉素的效价,都是大有益处的,研究生产过程中影响螺旋霉素成品中Ⅱ、Ⅲ组分含量的因素很有实际意义。
1材料与方法
1.1材料
螺旋霉素为本公司产品,乙酸丁酯、盐酸、草酸等化学试剂(Ap或Cp)均为北京化工厂产,乙腈为邯郸四友生物医学技术有限公司生产,甲酸铵为上海试剂一厂生产,异辛醇为齐鲁石化公司生产,控温式磁力搅拌器为江苏泰县分析仪器厂产,高效液相色谱仪为美国光谱物理公司产。
1.2操作方法
取本公司生产用的发酵液,然后用不同的酸化剂预处理过滤,得滤液,用氢氧化钠碱化后,用分液漏斗静置分层法,用不同的溶媒萃取,不同的酸水缓冲液体系在不同的pH,萃取时间等条件下进行反萃取对照试验,反萃取液结晶、干燥后得成品干粉,用高效液相色谱法测其组分。
1.3成品组分测定
采用HPLC测定,流动相为甲酸铵(0.1mol/L)-乙腈(体积比59.8:40.2)C18柱,流速为0.7ml/min,紫外检测波长232nm。
2结果与讨论
反萃取是决定成品质量的重要环节,萃取液的质量对成品质量起关键作用。反萃取主要从以下几方面进行分析:
2.1不同酸水缓冲液体系的反萃取
取生产上得到的乙酸丁酯萃取液2000ml,分别用为2.0的草酸-磷酸二氢钾、盐酸-磷酸二氢钾、盐酸溶液进行混合,反萃取,pH调到4.0左右,静置分层后分离,得到反萃取液,反萃取液过滤后得到杂质、滤液,再把滤液pH调至7.0,过滤后得到杂质、滤液,再把滤液pH调至9.5,温度55℃,结晶,对各步所得的杂质及SPM湿粉烘干,称重,如下表所示:
从生产工艺流程及理论进行杂质的分析,A1杂质主要是弱酸盐,如草酸盐,磷酸盐等,还有一些杂蛋白。A2主要是少量的不溶于水的氢氧化物(如氢氧化镁和氢氧化铝)和少量蛋白质。B1主要是杂蛋白,B2为磷酸盐和氢氧化物沉淀。C1主要是蛋白。C2是氢氧化物和少量蛋白质。
从成品分析,A3中杂质主要是少量的蛋白及氢氧化物沉淀,B3杂质主要是蛋白,还有钙、镁离子的磷酸盐和氢氧化物。C3中杂质为较多的弱酸盐及蛋白、氢氧化物。
从不同的酸水缓冲液体系所得到的成品的(HPLC)组分图谱分析,采用草酸-磷酸二氢钾酸水体系得到的螺旋霉素成品Ⅱ、Ⅲ组分最高。
2.2反萃取缓冲液体系最佳pH
由生产经验及理论得出,反萃取缓冲液的最佳pH应在2.0-2.5之间,如果pH低于2.0,由于酸性条件下螺旋霉素易分解,因此,加入酸水缓冲液的瞬间由于pH较低,会造成螺旋霉素的分解。如果pH太高,则造成反萃取液量较多,反萃取液效价低,在生产上不利于结晶操作。
2.3反萃取pH的影响
取相同的乙酸丁酯萃取液各1000ml7份,都用pH2.0的草酸-磷酸二氢钾缓冲液进行反萃取,分别调pH为2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,得反萃取液,经结晶、干燥后得螺旋霉素成品,测组分,绘出坐标曲线,见下图:
由上图看出,螺旋霉素Ⅱ+Ⅲ组分随反萃取时间的增加而降低,说明反萃取时间越长,SPM分解程度越大,因此,反萃取应在确保分离的情况下,越快越好。
2.5反萃取温度的影响
由于反萃取是放热过程,降低温度有利于反萃取进行,但如果反萃取温度太低,易在反萃取过程中产生乳化多,分离慢现象,因此,反萃取温度不宜过低,通过试验得出,反萃取温度在20-25℃之间为最佳。
3结论
3.1反萃取采用草酸-磷酸二氢钾酸水缓冲液体系,pH在2.0-2.5之间为宜,反萃取液pH控制在5.0-5.5之间。
3.2反萃取温度控制在20-25℃之间为最佳,反萃取时间应尽量缩短。
参考文献
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[2]冯闻铮,等.螺旋霉素在酸碱溶液中的降解动力学[J].药学学报199,32(12):943-937.
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