鸢尾黄素可拮抗鱼藤酮诱导PC12细胞损伤

鸢尾黄素可拮抗鱼藤酮诱导PC12细胞损伤

罗焱张新华陈勇军刘稀金李欣张平（通讯

南华大学附属南华医院神经内科湖南衡阳421001

【摘要】目的：探讨鸢尾黄素对鱼藤酮诱导的PC12细胞氧化应激的保护作用及其可能机制。方法：用鱼藤酮建立PC12细胞损伤模型，给予不同剂量的鸢尾黄素（5和10μmol?L-1）预处理30min后与鱼藤酮（1μmol?L-1）共同孵育细胞24h，采用CCK-8法检测细胞存活率，Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡，NBT还原法检测细胞内活性氧类物质（ROS）水平，比色法检测细胞内总超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果：与正常对照组相比，鱼藤酮（0.5、1和2μmol?L-1）组细胞存活率都下降（P<0.05），且呈剂量依耐性，而预处理5μmol?L-1和10μmol?L-1鸢尾黄素30min均可明显减轻1μmol?L-1鱼藤酮对PC12细胞增殖活力的抑制（P<0.05），改善鱼藤酮诱导的PC12细胞核固缩、裂解的现象，明显降低PC12细胞内ROS的含量（P<0.05），明显增加PC12细胞内SOD的活性（P<0.05）。结论：鸢尾黄素可拮抗鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与清除细胞内ROS，诱导抗氧化酶的活性有关。

【关键词】鸢尾黄素；鱼藤酮；PC12细胞；凋亡；氧化应激

帕金森病（Parkinsonsdisease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，在65岁以上人群发病率达到1%-3%，流行病学研究显示：环境因素在PD发病中起了重要作[1]。鱼藤酮（Rotenone）是从鱼藤的根部提取的一种天然复合物，被广泛用作杀虫剂和鱼塘、水库清理剂。研究证实鱼藤酮能抑制线粒体复合物I的活性，导致细胞对氧的利用障碍和能量产生不足，从而导致神经元细胞死亡；动物研究也表明鱼藤酮可导致黑质多巴胺能神经元变性，诱发帕金森样症状[2]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（pheochromocytoma，PC12）具有神经分泌细胞和神经元的性质，且PC12细胞在含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面接近中脑多巴胺神经元，现已成为国内外研究PD的常用细胞模型[3]。鸢尾黄素是一种天然存在的异黄酮类化合物，是中药材射干的有效成分之一，研究证实鸢尾黄素具有抗氧化，抗炎症，抗肿瘤等多种生物活性和药理作用[4]。因此，本研究采用鱼藤酮诱导PC12细胞损伤及氧化应激，探讨鸢尾黄素对其可能的保护作用及其机制。

1.材料与方法

1.1细胞、试剂及仪器

高分化大鼠PC12细胞购自中山大学医学实验动物中心；鸢尾黄素和鱼藤酮购自Sigma公司；CCK-8检测试剂盒和Hoechst33258染色液购自碧云天公司；RPMI-1640培养基、马血清、胎牛血清购自GibcoBR公司；活性氧类物质（ROS）检测试剂购自上海杰美基因医药科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自南京建成科技有限公司。鸢尾黄素用二甲基亚砜（DMSO）溶解配成20mmol/L的母液，-20°C冻存备用，临用时用完全培养液稀释至所用浓度，是终浓度DMSO的含量小于0.1%；鱼藤酮用DMSO溶解配成2mmol/L的母液，-20°C冻存备用，临用时用完全培养液稀释至所用浓度，DMSO的含量小于0.1%。主要仪器有：酶联免疫仪（美国Bio-TEK公司），紫外可见分光光度计（日本SHIMADZU公司），荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2细胞培养和分组

PC12细胞培养于RPMI1640培养基，内含10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，置于37°C、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，2d-3d传代培养，取对数生长期细胞用于实验。实验分组：（1）正常对照组：PC12细胞不加任何药物处理；（2）损伤组：1μmol?L-1鱼藤酮处理PC12细胞24h；（3）鸢尾黄素预处理组：鸢尾黄素（5和10μmol?L-1）预处理PC12细胞30min后，再加入1μmol?L-1鱼藤酮共同培养24h；（4）鸢尾黄素单独处理组：10μmol?L-1鸢尾黄素处理PC12细胞24h。

1.3CCK-8检测细胞存活率

细胞以105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，每组设置4-6个复孔，待细胞长到60%-70%时，按上述方法加药处理细胞24h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续于37°C孵育3h，酶标仪450nm测定各孔OD值。细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率（%）=（OD实验-OD空白）/（OD对照-OD空白）x100

1.4Hoechst33258染色检测PC12细胞凋亡

将PC12细胞接种于6孔板内的盖玻片上，待细胞长到70%-80%时，各实验组按要求给以不同处理因素作用24h后，倒掉培养基，4°C预冷PBS洗涤3遍后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛于4°C固定10min，再用预冷PBS洗涤3遍，加入0.5mLHoechst33258染色液避光染色10min，PBS洗涤3遍，荧光显微镜观察、摄片。正常细胞核出现弥漫均匀的低强度荧光，细胞核如呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光，记为凋亡的细胞。

1.5NBT还原法测活性氧（ROS）

将对数生长期的细胞均匀接种于96孔板中，每孔100μL，每组设5个平行对照，在37°C、5%CO2条件培养，待细胞长至70%-80%满时，根据不同组别给予药物处理24h后，去掉培养基，加1×NBT（1mg/ml）溶液100μl，5%CO2、37°C条件下培养2h后，弃掉NBT溶液，用PBS冲洗细胞2次，分别依次加入100μL的KOH（2mol/L），100μL的DMSO，然后在570nm波长处检测OD值。

1.6PC12细胞内总SOD活力的测定

将PC12细胞接种于6孔板，各实验组按要求给以不同处理因素作用24h后，收集各组细胞，1000r/min离心5min，弃上清，PBS清洗细胞3遍，再加入细胞裂解液，冰上裂解30min，将液体移取于1.5mL离心管，4°C、10000r/min离心1h，取上清液4°C保存，参照SOD试剂盒说明书测定细胞内总SOD活性。SOD活力单位定义：每毫克蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

1.7统计学处理

数据以x±s表示，使用SPSS11.5软件进行统计学处理，数据采用单因素方差分析（ANOVA）各组间差异，检验分析两两间差异以P<0.05判定为有统计学差异。

2.结果

2.1鸢尾黄素对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的影响见表1。鱼藤酮呈浓度依耐性降低PC12细胞活力，2μmol?L-1鱼藤酮处理组细胞活力仅为对照组的（25.37±6.97）%，所以选用鱼藤酮浓度为1μmol?L-1作为后续试验建模。同时。我们发现预处理5μmol?L-1鸢尾黄素30min开始出现对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的抑制作用，细胞活力较鱼藤酮组增加，差异具有统计学意义（P<0.05），当鸢尾黄素浓度为10μmol?L-1时其保护作用更强，PC12细胞活力上升到（82.51±2.55）%。差异均具有统计学意义（P<0.01）。

2.2鸢尾黄素能抑制鱼藤酮诱导的凋亡我们在荧光显微镜下观察发现，正常组细胞核呈蓝色，边缘光滑，均匀淡染（图1A），鱼藤酮模型组部分细胞核固缩，呈致密浓染，显示较强荧光，甚至可见胞核裂解，这些均为细胞凋亡的特征性表现（图1B），而鸢尾黄素预处理组胞核形态改，荧光强度减弱（图1C，D），鸢尾黄素单独处理组与对照组对比，细胞形态没有发生改变（图1E），这些结果提示鸢尾黄素能在一定程度上抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞的凋亡。

A.空白对照组；B.鱼藤酮组；C.低浓度鸢尾黄素+鱼藤酮组；D.高浓度鸢尾黄素+鱼藤酮组；E.高浓度鸢尾黄素组

图1鸢尾黄素对鱼藤酮诱导的PC12细胞形态的影响（×100）

2.3鸢尾黄素抑制鱼藤酮诱导的氧化应激见表2。鱼藤酮作用24h后，细胞内ROS含量较对照组组明显升高，预处理鸢尾黄素（5μmol?L-1或者10μmol?L-1）30min，各组细胞内ROS含量分别较鱼藤酮组逐渐下降，且存在浓度依赖性，差异均具有统计学意义。而鱼藤酮处理PC12细胞24h后，可以检测到细胞内总SOD活力显著降低（与正常对照组相比P<0.01）；鸢尾黄素（5、10μmol?L-1）预处理30min后和鱼藤酮共同孵育PC12细胞24h，均能明显减轻了鱼藤酮诱导的PC12细胞内总SOD活力的降低。

表2鸢尾黄素对鱼藤酮诱导的PC12细胞氧化应激的影响

与对照组比较，**P<0.01；与鱼藤酮处理组比较，#P<0.05，##P<0.01

3讨论

大量研究发现，神经细胞内氧化应激反应增强导致ROS产生过多，从而导致多巴胺能神经元凋亡与PD的发病有密切关系[5]。近年来，抗氧化成为PD发病机制研究的一个热点，寻找有效的抗氧化剂也然成为预防和治疗PD的首要任务。鱼藤酮能选择性抑制线粒体复合物1的活性，引发脂质过氧化和ROS的过度生成，进一步导致氧化应激并诱导细胞凋亡[6]。分化PC12细胞具有典型的神经内分泌特征，能够模拟多巴胺能神经元，因此本实验采用鱼藤酮诱导PC12细胞的方法建立帕金森病模型。近年来的研究显示，鸢尾黄素与其它酮类化合物一样具有清除自由基和抗氧化的能力，有很好的自由基捕获能力[3]。Wozniak等现射干提取物含鸢尾黄素有清除二苯代苦味酰肼（DPPH）自由基的作用[7]。KangKA等人的深入研究表明，鸢尾黄素能拮抗H2O2诱导的细胞损伤，其机制与它能提高细胞内的抗氧化酶的活性及其表达密切相关[8]。但是，鸢尾黄素对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤及氧化应激是否具有保护作用尚未见报道。

本研究CCK-8检测结果显示：随着鱼藤酮浓度的增加PC12细胞活力逐渐降低浓度，鱼藤酮浓度为2μmol?L-1细胞活力仅为对照组的（5.37±6.97）%，因此，实验中选定5μmol?L-1鱼藤酮为后续造模条件。实验发现加入不同剂量的鸢尾黄素预处理30min后和鱼藤酮共同孵育PC12细胞24h，各组细胞存活率明显高于鱼藤酮单独处理组，并且随着鸢尾黄素剂量的增加，PC12细胞活力增加，有剂量依赖效应，说明鸢尾黄素可促进PC12细胞活力的恢复，从而减轻鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤。鸢尾黄素能够降低细胞内ROS水平以及增加抗氧化酶的活性而拮抗H2O2诱导的细胞损伤[7]。本实验以NBT还原法检测细胞内ROS水平，结果显示鱼藤酮能诱导细胞内ROS水平的升高，而鸢尾黄素呈剂量依耐性的降低细胞内ROS的水平。超氧化物歧化酶（SOD）是机体主要的抗氧化酶之一，能催化超氧化物歧化成H2O2和O2，这些H2O2再通过过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等的催化转化成无毒的H2O[9]。本实验亦发现5μmol?L-1或者10μmol?L-1鸢尾黄素具有明显的诱导SOD活性，SOD活力较鱼藤酮组呈剂量依赖性显著增加，且鸢尾黄素预处理后细胞核固缩、裂解现象减少、细胞核形态改善。这些现象进一步说明鸢尾黄素具有提升细胞基础抗氧化能力的作用，在预防PD中可能起着重要的作用。

总之，鸢尾黄素对鱼藤酮所致PC12细胞损伤和氧化应激具有保护作用，其机制可能与其抗氧化、清除细胞内ROS、诱导抗氧化酶的活性有关，为进一步研究鸢尾黄素对PD的治疗作用提供一定的理论和实验依据。

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通讯作者，张平，男，1975年生，硕士，副教授，副主任医师，研究方向：神经退行性疾病防治。

基金项目：南华大学“十二五”科技创新团队项目2014KJ54