中药补肾调冲方对卵巢早衰大鼠性激素水平及SCF、Cx-37蛋白表达的影响

中药补肾调冲方对卵巢早衰大鼠性激素水平及SCF、Cx-37蛋白表达的影响

李欣捧1高慧2(通讯作者)徐文君1崔亚萌1张

(1华北理工大学河北唐山063000)

(2承德医学院附属医院中医科河北承德067000)

(3河北省中西医结合肝肾病证重点实验室河北石家庄050091）

【摘要】目的：观察补肾调冲方对大鼠卵巢早衰模型LH、FSH、E2、AMH水平及Cx-37、SCF蛋白表达的影响。方法：70只SD雌性大鼠随机分为：对照组,模型组,补肾调冲方低、中、高剂量（以生药计24、12、6g/kg）组,坤泰胶囊组（6g/kg）,结合雌激素片（阳性药）组。除对照组以外,其他各组均连续应用ig雷公藤多苷片造模14d,在造模结束24h后,分别给予各组相应药物36d。给药后,应用Elisa法检测血清FSH、LH、E2、AMH水平,免疫组化法检测Cx-37、SCF蛋白的表达。结果：与对照组比较,模型组FSH、LH水平、SCF蛋白的表达均显著升高,E2、AMH水平、Cx-37蛋白的表达显著降低（P＜0.05）;与模型组比较,各给药组FSH、LH水平、SCF蛋白表达均显著降低,E2、AMH水平、Cx-37蛋白表达显著升高（P＜0.01）。结论：补肾调冲方可增强卵巢早衰大鼠的卵巢储备能力,促进卵泡发育,对卵巢早衰可能有治疗作用。

【关键词】中药补肾调冲方;卵巢早衰;卵泡刺激素、促黄体生成素、雌激素、抗缪勒管激素、卵巢干细胞因子SCF、缝隙连接蛋白Cx-37

【中图分类号】R28【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2018）04-0036-03

【Abstract】ObjectiveToobserveBushenTiaochongDecoctiononprematureovarianfailuremodelratsserumFSHandLH,E2,AMHlevelsandSCF,Cx-37proteinexpressioninfluence.Methods70femaleSDratswerepidedinto7groups.Excptthecontrolgroup,theothergroupswereigtripterygiumglycosidestablets14d,themoldfinished24h,giventhecorrespondingdrugtreatment36d.Afteradministration,ElisawasusedtodetectFSH,LH,E2andAMHlevelsinrats,theexpressionofSCFandCx-37proteinwasdetectedbyimmunohistochemistry.ResultsComparedwiththecontrolgroup,theexpressionlevelsofFSH,LHandSCFproteinlevelswereincreased,theexpressionofE2,AMH,Cx-37proteinlevelwaslower(P<0.05);comparedwiththemodelgroup,theexpressionofeachgroupFSH,LHandSCFproteinlevelsweredecreased,theexpressionofE2andAMHandCx-37proteinincreased(P<0.01).ConclusionTherecipeofBushenandpunchingcanimprovetheovarianreservecapacity,promotedevelopmentoffollicle,andmayhavetherapeuticeffectonprematureovarianfailure.

【Keywords】TraditionalChinesemedicineBushenrecipe;Prematureovarianfailure;folliclestimulatinghormone,luteinizinghormone,estrogen,antiMuellerhormone,ovarianstemcellfactorSCF,gapjunctionproteinCx-37

卵巢早衰指40岁以下的女性持续闭经且性器官出现萎缩，LH、FSH升高，E2降低的综合征。近年来卵巢早衰发病率不断上升，并向年轻化发展。诊断：年龄＜40岁；连续停经>4个月；FSH＞40mIU/mL，LH＞30mIU/mL，E2＜25mIU/mL。AMH由颗粒细胞分泌，参与抑制始基卵泡到初级卵泡的生长。SCF存在于大鼠卵巢次级卵泡内的颗粒细胞，是卵巢局部重要的旁分泌因子，在卵巢生长发育过程中起重要的调控作用。Cx-37广泛存在于生殖细胞之间，构成了颗粒细胞与卵母细胞间的缝隙连接细胞间通讯，为卵母细胞的正常发育提高营养，以及传递其成熟分化的信号分子。本实验通过观察补肾调冲方对卵巢早衰大鼠血清中FSH、LH、E2、AMH及SCF、Cx-37蛋白表达的影响，为补肾调冲方干预卵巢早衰的临床应用提供依据。

1.材料与方法

1.1材料

雌性SD大鼠70只，12周龄，250～280g。中药补肾调冲方：菟丝子15g，熟地15g，黄精15g，巴戟天10g，肉苁蓉10g，川芎6g，当归10g，五味子6g，紫石英15g。结合雌激素片，0.625mg/片；雷公藤多苷片，10mg/片；坤泰胶囊，0.5g/粒。ELISA试剂盒，AMH试剂盒，兔抗鼠SCF多克隆抗体，兔抗鼠Cx-37多克隆抗体，免疫组化试剂盒。

1.2方法

将大鼠随机分：对照组，模型组，补肾调冲方高、中、低剂量组，坤泰胶囊组，结合雌激素片组。除空白组外，均给予ig雷公藤多苷片，根据前期实验[1]，以75mg/kg连续ig14d。连续两个动情周期行阴道涂片，动情周期紊乱，延长至6～10天提示造模成功。造模后给予补肾调冲方6g/kg、12g/kg、24g/kg，坤泰胶囊0.6g/kg，结合雌激素片75μg/kg灌胃。除模型组、对照组，余给药体积均为0.1mL/kg，连续给药36d，每日检测阴道涂片。处死动物，血液标本离心取上层血清，应用ELISA试剂盒测定各激素水平，利用酶标仪分组测量吸光度（A）。免疫组化检测卵巢细胞，胞浆呈黄色颗粒状或淡黄色为阳性表达。检测每张组织切片中的SCF及Cx-37表达的积分光密度（A）值。

1.3统计学处理

采用SPSS21.0进行分析，计量资料用（x-±s）表示，组间比较用方差分析。P＜0.05有统计学意义。

2.结果

2.1血清FSH、LH、E2、AMH的测定

较对照组，模型组FSH、LH升高，E2、AMH降低（P＜0.05）；与模型组相比，给药组FSH、LH降低，E2、AMH升高（P＜0.01）；与坤泰胶囊组比，补肾调冲方中、低组FSH、LH、E2、AMH无明显差异，与高剂量组、结合雌激素组差异显著（P＜0.05）；与结合雌激素组比较，补肾调冲方高剂量组FSH、LH、E2、AMH水平无明显差异，中、低剂量组差异显著（P＜0.05）。见表1。

与对照组比较：*P＜0.05;与模型组比较：△P＜0.01;与坤泰胶囊组比较：#P＜0.05;与结合雌激素组比较：☆P＜0.05。

3.讨论

卵巢早衰发病率不断上升，西医对此病因研究较多，但尚无确切病因病机，无法根治；中医无卵巢早衰概念，将其归于血枯、经闭，围绕肾气-天癸-胞宫轴进行整体的调理，促卵巢功能。补肾调冲方具滋补肝肾，调理冲任之功效，故肾气盛，任冲脉通，则月事以时下[2]。

雷公藤多苷片有抗炎、抗癌之功效，并用于治疗肾炎、类风湿，长期应用损伤消化、血管、生殖等器官。王瑛等[3]通过对雷公藤多苷片治疗肾炎、类风湿女性患者进行观察，发现均有不同程度的月经不调及闭经。高慧等[4]首次将雷公藤用于大鼠卵巢早衰模型的制备。

临床上以FSH、LH、E2、AMH作为卵巢功能的评判指标，E2在FSH作用下由窦卵泡生成，当卵泡数量下降时，E2水平也随之下降，从而FSH水平升高。AMH可抑制窦前卵泡的生长，降低卵泡对FSH的敏感性，继而减少原始卵泡的数量[5]。迄今为止，AMH是唯一可抑制始基卵泡发育的因子，且能很好的反映卵泡储备情况[6]。有研究表明，卵巢功能衰退早期，AMH水平的变化比FSH等激素更早地出现变化，因此可更及时地采取措施来减缓卵巢衰老[7]。应用雷公藤后，FSH、LH升高，E2、AMH降低。造模后应用补肾调冲方高剂量与雌激素治疗，与模型组相比，血清FSH、LH降低，E2、AMH升高，说明中药补肾调冲方可改善血清FSH、LH、E2、AMH水平，防止卵泡过早衰竭，调节卵巢功能。

干细胞因子（SCF）是卵巢局部重要的旁分泌因子，对卵巢的生长发育有调节作用[8]。赵红岩[9]等研究发现，颗粒细胞可产生SCF，而SCF又可促进颗粒细胞的生长发育，二者互相促进，在早期卵泡发育过程中起重要作用。本研究中，较对照组，模型组SCF显著升高（P＜0.05）；较模型组，补肾调冲方各剂量组及坤泰胶囊组、结合雌激素组SCF明显降低，其中补肾调冲方高剂量组、结合雌激素组效果优于其他各组，补肾调冲方中、低剂量组与坤泰胶囊组无明显差异。说明补肾调冲方可减弱SCF蛋白的表达，促进早期卵泡的生长发育，防止卵巢早衰的发生。

缝隙连接蛋白（Cx-37）为卵母细胞提供营养，并传递信号分子使其成熟分化。KiddderGM[10]等发现，卵母细胞和颗粒细胞之间的缝隙连接必须有Cx-37的参与，缺少Cx-37会影响腔前卵泡的发育，进而影响卵泡的成熟。本研究发现，较对照组，模型组Cx-37蛋白表达降低（P＜0.05）；较模型组，补肾调冲方各剂量组及坤泰胶囊组、结合雌激素组Cx-37蛋白表达升高，其中补肾调冲方高剂量组、结合雌激素组效果优于其他各组。说明补肾调冲方高剂量可有效增强Cx-37蛋白的表达，改善大鼠卵巢组织缝隙连接功能，恢复卵巢功能。

综上所述，中药补肾调冲方滋补肝肾，调理冲任，有治疗卵巢早衰的作用，通过调节激素水平及下调SCF蛋白、上调Cx-37蛋白的表达，减轻雷公藤造成的药源性卵巢损伤，促卵泡发育，防止卵巢早衰的发生。

【参考文献】

[1]梁策，高慧，张腾，等.补肾调冲方对卵巢早衰大鼠性激素水平和卵巢Bcl-2/Bax表达的影响.生殖与避孕，2016，36(5):359-364.

[2]夏天，高慧，柴淑娟，等.韩冰教授运用冲任学说治疗卵巢功能失调性疾病的研究总结[J].天津中医药，2011，28(4):271-273.

[3]王瑛，刘元.坤泰胶囊治疗雷公藤引起类风湿关节炎卵巢早衰的临床观察[J].陕西中医，2015，36(7):773-774.

[4]高慧，杨涓.药物型卵巢早衰动物模型的研究[J].国医论坛，2007，22(3):22-26.

[5]VisserJA，JongFH，LavenJS，etal.Anti-Mullerianhormone:anewmarkerforovarianfuncion[J].Reproduction，2006，131(1)1-9.

[6]陈秀英，李斌.抗苗勒管激素在女性生殖系统的研究进展[J].国际妇产科学杂志，2013，40(2):123-125.

[7]KnauffEA，EijkemansMJ，LambalkCB，etal.Anti-Mullerianhormone，inhibinB，andantralfolliclecountinyoungwomenwithovarianfailure[J].JClinEndocrinolMetab，2009，94(3):786-792.

[8]AbirR，FischB，JinS，etal.Expressionofstemcellfactoranditsreceptorinhumanfetalandadultovaries[J].FertilSteril，2004，82(Suppl3):1235-1243.

[9]赵红岩，孙莹璞.干细胞因子和白血病抑制因子对冻融后人原始卵泡体外生长发育的研究[J].生殖与避孕，2010，30(8):523-528.

[10]KiddderGM，MhawiAA.Gapjunctionsandovarianfolliculo-genesis[J].Reproduction，2001，123(5):613-620.

基金项目：

1.河北省省级重大医学科研项目（No.zyzd2013018）；

2.河北省政府资助临床医学优秀人才培养项目（No.2014571024）；

3.国家中医药管理局全国名老中医药专家高慧传承工作室建设项目（No.2015048157）。