独活寄生汤对兔腰椎间盘突出症模型中胶原蛋白基因影响的实验研究

独活寄生汤对兔腰椎间盘突出症模型中胶原蛋白基因影响的实验研究

孙湘云1李洲进2

1湖南中医药大学4102082湖南中医药大学第二附属医院410000

[摘要]目的通过观察独活寄生汤对模型兔腰椎间盘退变髓核中胶原蛋白基因表达量的变化，探究该药对腰间盘退变的保护作用。方法新西兰大白兔60只，其中随机抽选40只建立腰椎间盘退变模型，造模成功后，随机分为模型组和研究组，每组20只；另20只为假手术组。研究组按照9.5g·kg-1独活寄生汤进行灌胃，模型组和假手术组按照等剂量标准进行生理盐水灌胃，早晚各一次，连续灌胃给药8周后处死，通过PT-PCR检测胶原蛋白（COL-1a、COL-2a）基因表达量的变化。结果药物干预后，三组兔子椎间盘组织Ⅰ、Ⅱ型胶原（COL-1a、COL-2a）表达水平组间比较有统计学差异，P均<0.05；模型组COL-1a表达水平均高于假手术组和研究组，而COL-2a呈相反趋势；研究组和假手术组的椎间盘组织COL-1a表达水平比较，及两组的COL-2a表达水平比较无统计学差异；P>0.05。结论通过独活寄生汤可以降低腰椎间盘退行性Ⅰ型胶原蛋白的表达，同时增加Ⅱ型胶原蛋白的表达，对腰间盘退变的具有保护作用。

[关键词]独活寄生汤；腰椎间盘突出症；胶原蛋白；基因表达

随着人口的老年化，老年人的相关问题将日渐突出，椎间盘退变引起的相关疾病的发病率随着人口的老年化呈逐渐上升的趋势，是老年人脊柱痛的常见病因，严重影响病人的生活质量，给患者和国民经济造成沉重的经济负担[1,2]。无论采用保守治疗还是手术治疗均不能从本质上减缓病变的发生发展[3]。独活寄生汤是临床上常见的治疗腰椎间盘退变相关疾病的传统中药方剂，其具有抗炎镇痛及抗损伤作用，镇痛作用强度为乙酰水杨酸钠的17倍[4]。国内对独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症已有报道，但其对椎间盘终板的形态学改变及胶原蛋白表达的影响尚不清楚[5]。通过检测胶原蛋白（COL-1a、COL-2a）基因表达量的变化，探讨独活寄生汤治疗腰椎间盘退变的可能效应机制，为“独活寄生汤”治疗腰椎间盘退变的临床运用提供试验依据。

第一作者：孙湘云，湖南中医药大学研究生通讯作者：李洲进，医学硕士，主治医师，研究方向：脊柱脊髓疾病的诊治

湖南中医药管理局资助课题（项目编号：201734）

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物

成年新西兰白兔60只(雌雄不限，体质量1.8-2.0kg)，由北京科宇动物养殖中心代购及饲养，动物许可证编号：SCXK(京)2018-0010。试验方案经医学动物实验伦理委员会审批通过。

1.1.2实验药物采用广东一方颗粒饮片，具体处方组成如下：独活9g、桑寄生6g、秦艽6g、防风6g、川芎6g、当归6g、赤芍6g、生地6g、细辛6g、肉桂心6g、茯苓6g、杜仲6g、牛膝6g、党参15g、甘草6g，每付中药开水250mL冲配。

1.2方法

1.2.1动物准备

新西兰大白兔60只，其中随机抽选40只参照Satoshisobajima的方法建立腰椎间盘退变模型，造模成功后，随机分为模型组和研究组，每组20只；另20只为假手术组。

1.2.2独活寄生汤给药方法

研究组每天按成人与兔的体表面积换算标准（9.5g·kg-1）喂服所需剂量药物，假手术组及模型组灌服等剂量的生理盐水，早晚各一次，连续灌胃给药8周后处死，采取标本，进行各项实验。

1.2.3采取标本及指标检测方法

取出L5/S1椎间盘，迅速放入事先预冷并编号好的取材盒中，置于液氮中保存，用RT-PCR法检测col-1a、col-2a。

1.3统计学分析

采用SPSS22.0软件统计学处理分析文中数据，文中数据均进行正态性检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较进行独立样本t检验；P<0.05代表有统计学差异。

2结果

2.1三组椎间盘Ⅰ、Ⅱ型胶原（COL-1a、COL-2a）蛋白表达水平比较

药物干预后，三组兔子椎间盘组织Ⅰ型胶原（COL-1a）蛋白表达水平组间比较有统计学差异，P<0.05；模型组COL-1a蛋白表达水平高于假手术组和研究组，P均<0.05，研究组和假手术组的椎间盘组织COL-1a蛋白表达水平比较无统计学差异，P>0.05。三组兔子椎间盘组织Ⅱ型胶原（COL-2a）蛋白表达水平组间比较有统计学差异，P<0.05；模型组COL-2a蛋白表达水平低于假手术组和研究组，P均<0.05；研究组和假手术组的椎间盘组织COL-2a蛋白表达水平比较无统计学差异，P>0.05。详见表2。

3讨论

正常椎间盘主要由髓核、纤维环、终板构成，髓核及纤维环主要成分是胶原蛋白和水分；椎间盘基质主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成，但在椎间盘的不同位置存在着显著差异[6]。胶原蛋白则以Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白为主。椎间盘胶原体系的胶原类型主要由间质型胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基底膜胶原Ⅳ，微量胶原Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ等。在纤维环中，由外到内的成分是不同的[7]。外层主要是Ⅰ型胶原蛋白，它有较强的韧性，能抗张力，使得椎间盘有较强的抗压能力。内层（纤维环和髓核）主要是Ⅱ型胶原，它有很强的保水能力，能缓冲椎间盘受到的压力；可保持水扥并承受及吸收传导压力。椎间盘从外到内，纤维环的含水量逐渐增加。髓核中基本不含Ⅰ型胶原蛋白，主要由Ⅱ型胶原蛋白和水组成。当椎间盘发生退变时，整个椎间盘的含水量逐渐减少，而且伴有Ⅰ型胶原蛋白的增对和Ⅱ型胶原蛋白的减少[8,9]。Ⅱ型胶原由于椎间盘细胞受到失稳状态中非生理平衡作用力、各种炎症介质、自由基等外来干扰因素影响，基因处于不能转录或者关闭状态，无新生Ⅱ型胶原合成，在退变过程中红原胶被激活的胶原酶。明胶酶及其他各种中性蛋白酶作用下分解加剧，椎间盘中Ⅱ型胶原代谢失去平衡，胶原结构框架出现变性、损坏、松散紊乱[10]。本研究利用独活寄生汤干预，探究其对腰椎间盘退行胶原蛋白表达的影响。

本研究显示，服用独活寄生汤后，三组兔子椎间盘组织Ⅰ、Ⅱ型胶原（COL-1a、COL-2a）表达水平组间比较有统计学差异；说明服用独活寄生汤可以通过调节Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白的不同表达，从而对腰间盘退变的具有保护作用。

参考文献

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[3]吴成爱,江晓舟,郑山,等.椎间盘退变中asporin的作用机制研究[J].中华骨科杂志,2017,37(14):871-878.

[4]徐晓杰.独活寄生汤对膝骨性关节炎软骨退变病理改变的影响[J].亚太传统医药,2017(11):86-87.

[5]赵富强.独活寄生汤加减治疗退行性膝关节骨性关节炎疗效观察[J].医药前沿,2016,6(13):364-365.

[6]张瑞.中医综合治疗退行性腰椎滑脱症66例[J].中医研究,2017,30(7):57-59.

[7]范帅,李飞龙,曾建春.观察独活寄生汤、中药封包联合治疗膝关节退行性骨关节炎疗效[J].中国现代药物应用,2018(7):145-146.

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[9]曹洪,郑世勤,吴小梅,等.独活寄生汤治疗骨关节炎的研究进展[J].湖北医药学院学报,2017(01):95-97.

[10]贾峻,荣兵,李建,等.独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞代谢,BMP-7及SIRT1表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2017(17):167-173.