荧光定量PCR分型法检测乙肝病毒B、C基因型的方法学的应用研究

荧光定量PCR分型法检测乙肝病毒B、C基因型的方法学的应用研究

梁聪

梁聪

（苏州市姑苏区疾病预防控制中心江苏苏州215007）

【摘要】目的：探讨荧光定量PCR分型法检测乙肝病毒B、C基因型的方法学的应用价值，掌握不同类型感染者的基因型分布特征。方法：随机选择在我院接受诊疗的73例乙型肝炎患者，对其临床资料进行回顾性分析，所有患者均采用荧光定量PCR分型法进行检测，判断患者基因型。结果：利用荧光定量PCR分型法成功分型70例（95.9%），其余3例（4.1%）未检出；70例成功分型的患者中，B型45例/61.6%，C型11例/15.1%，B/C混合型14例/19.2%，B型显著高于C型、B/C混合型，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：荧光定量PCR分型法检测乙型肝炎患者，分型成功率较高，且乙肝病毒以B基因型为主。

【关键词】荧光定量PCR分型法；乙肝病毒；基因型

【中图分类号】R512.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）17-0194-02

临床及时对乙型肝炎做出诊断，对制定良好的诊疗措施具有指导作用。本研究主要荧光定量PCR分型法检测乙肝病毒的应用价值，并对B、C基因型分布规律进行分析，为此选择我院2012年8月～2015年10月73例乙型肝炎患者进行详细说明，现对结果进行汇报。

1.资料与方法

1.1一般资料

根据随机方法选择在我院进行诊治的73例乙型肝炎患者，将其作为本研究的主要观察对象，对其临床资料进行回顾性分析。本组男性患者42例，女性患者31例，年龄15～78岁，平均年龄（45.26±2.74）岁。所选病例均符合乙型肝炎相关诊断和治疗标准[1]，且患者及家属对我院相关诊治情况知情，由患者本人或家属签订治疗同意书。

1.2排除标准[2]

（1）年龄超过80岁者；（2）合并其他内科严重疾病者；（3）无家属者；（4）多种原因造成无法正常沟通者，如精神疾病或交流障碍者。

1.3试验方法

1.3.1血样采集：取患者清晨空腹肘静脉血5mL，排除发生溶血、脂血现象的血液标本，将其保存在无抗凝剂的干燥试管中。在试管中添加50μL核酸的提取液，以3000r/min、半径15cm离心10min，分离后的血清要及时冷冻在冰箱中，温度控制在零下40℃左右，将其作为荧光定量PCR分型反应的模板。

1.3.2试剂及检验仪器：荧光定量PCR分型仪由德国相关公司提供，酶标仪则由美国公司提供。HBV-DNA提取试剂、PCR分型反应试剂盒、引物、探针级乙肝标志物均由我国公司自主生产。检测的灵敏度：4.2*102U/L。

1.3.3检测方法：利用荧光定量PCR分型仪对血清标本开展基因型定量检测，当基因扩增时，要取4μL上清液，并在其中添加36.4μL各种基因型混合液，充分混合均匀后以3000r/min、半径15cm离心处理30s，分别向其中添加B型C型荧光探针。反应条件：50℃*2min；扩增程序：94℃*3min。之后按照94℃*15s、55℃*30s循环处理40次，整个荧光定量PCR分型检测要在65℃条件下执行。

1.4数据统计

文中数据采用spss18.0软件进行处理，计数资料采用%表示，资料采用卡方（χ2）检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2.结果

利用荧光定量PCR分型法成功分型70例（95.9%），其余3例（4.1%）未检出；70例成功分型的患者中，B型45例/61.6%，C型11例/15.1%，B/C混合型14例/19.2%，B型显著高于C型、B/C混合型，差异具有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。

3.讨论

乙型肝炎患者长期受到病毒感染，可造成肝硬化，且能够直接发展成为肝癌，对患者身体健康具有较为严重的影响。乙型肝炎患者受到乙肝病毒的影响，在长期感染的情况下，乙肝病毒会发生突变，因此形成乙型肝炎基因型。对患者乙肝基因型做出准确判断，对制定临床诊疗措施意义重大。

乙肝病毒共分为8个基因型，分别为A、B、C、D、E、F、G、H，且呈地域性分布，我国主要以B基因型和C基因型感染为主，同时也存在B/C混合型。对患者进行定量分型，可准确判断预后情况，并对用药治疗做出科学指导。目前，荧光定量PCR分型法是检测乙肝病毒基因型的主要方法，属于高分子生物学技术，具有灵敏度高、检测方便等优势，在临床检验工作中具有广泛的用途。

本研究结果显示：采用荧光定量PCR分型法成功分型70例（95.9%），其余3例（4.1%）未检出；同时，70例成功分型的患者中，B型、C型及B/C混合型所占比例分别为61.6%、15.1%、19.2%，其中B型显著高于C型、B/C混合型，差异明显（P＜0.05）。上述结果与权威文献研究结果基本相符[3]，说明荧光定量PCR分型法检测乙型肝炎患者，分型成功率较高，同时表明本地区乙肝病毒感染主要以B基因型为主，临床应予以重视，并以此为根据制定对症诊疗措施。

表1荧光定量PCR分型法分型情况

*

注：与其他分型相比，*P＜0.05

【参考文献】

[1]张秀瑜，赵耀，张文露等.荧光定量分型PCR检测重庆地区乙型肝炎病毒感染者HBV基因型分布特征[J].中国生物制品学杂志，2012，11（01）：91-94.

[2]苏荣，罗娜，杨延斌等.HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者乙肝病毒基因变异和分型研究[J].南方医科大学学报，2012，17（12）：1804-1807.

[3]申旭霞，周燕，赵超芬等.荧光定量聚合酶链反应分型法检测乙型肝炎病毒B、C基因型的研究[J].医学综述，2013，19（15）：2819-2820+2823.