类风湿关节炎患者炎性环境对间充质干细胞的影响

类风湿关节炎患者炎性环境对间充质干细胞的影响

蒋志琼1唐中2肖波3(通讯作者)吴碧华1

蒋志琼1唐中2肖波3(通讯作者)吴碧华1

(1四川省南充市川北医学院附属医院老年科637000)

(2四川省南充市川北医学院附属医院检验科637000)

(3四川省南充市川北医学院附属医院影像科637000)

【摘要】探讨类风湿关节炎(RA)患者炎性环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)生物学特性的影响。方法采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法培养MSCs。将MSCs分别与不同浓度的RA血清、关节液共培养，MTT法检测吸光度值(A值)。计算RA血清作用后的MSCs对T细胞增殖的抑制。关节液作用后的MSCs成骨诱导，RT-PCR检测骨桥蛋白基因的表达。结果密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功培养MSCs。10%浓度血清组的A值是0.28±0.04，30%组为0.33±0.09；对照组则分别为0.31±0.01，0.44±0.16。实验组MSCs对T细胞的抑制率为35%，对照组为48%。10%浓度关节液组的A值是0.23±0.03，30%是0.23±0.07，50%的是0.19±0.06，对照组为0.27±0.05。实验组MSCs的骨桥蛋白基因表达高于对照组。结论骨髓MSCs的培养扩增技术成熟。RA血清对MSCs的增殖及其对T细胞增殖的抑制没有影响。较高浓度的关节液对MSCs的增殖有抑制作用，但可促进其向成骨细胞分化。

【关键词】类风湿关节炎炎性环境间充质干细胞

【中图分类号】R329.2+8【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）18-0036-03

TheinflammatoryenvironmentofRheumatoidarthritispatientsontheimpactofmesenchymalstemcells

JIANGZhiqiong1,TANGZhong2,XIAOBo3,WUBihua1

【Abstract】PurposeToinvestigatethebiologicalcharacteristicsinfluenceofinflammatoryenvironmentfromrheumatoidarthritis(RA)patientstomesenchymalstemcells(MSCs).MethodCultureandamplificationofbonemarrowMSCswereperformedbysimpleadherencescreeningmethodanddensitygradientcentrifugation.MSCsintheculturemediumweretreatedrespectivelywithserumandjointfluidofRApatientsatdifferentconcentrations.TheabsorbanceofMSCswasdetectedbyMTTmethod.TheMSCswereculturedwithTcellsaftereffectionofRApatients’serum,thentheTcellproliferationinhibitionratewascalculated.TheexpressionofosteopontinwasdetectedbyRT-PCRmethodafterMSCstreatedwithjointfluid.ResultMSCsweresuccessfullyculturedbysimpleadherencescreeningmethodanddensitygradientcentrifugation.TheAvaluewas0.28±0.04fortheconcentrationof10%bloodserum,and0.33±0.09forthe30%inexperimentalgroup.TheAvaluewas0.31±0.01and0.44±0.16forthecontrolgroup,respectively.TheinhibitionrateofTcellproliferationwas35%forexperimentalgroup,and48%forthecontrolgroup.TheAvaluewasrespectively0.23±0.07fortheconcentrationof10%jointfluid,0.19±0.07for30%,0.16±0.05for50%,lessthan0.25±0.01inthecontrolgroup.Theexpressionofosteopontingeneintheexperimentalgroupwashigherthanthecontrolgroup.ConclusionThetechnologyofcultureandamplificationofbonemarrowMSCswasmature.TheserumofRApatientshasnoeffectonproliferationofMSCsandtheinhibitionofMSCstoTcells.ThegrowthofMSCswasinhibitedbyhighconcentrationsofjointfluid,andpromotedtotheosteoblastdifferentiation.

【Keywords】RheumatoidarthritisInflammatoryenvironmentMesenchymalstemcells

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一种起源于中胚层的非造血多能干细胞，目前已经能够从骨髓、外周血、脐带血、滑膜、滑液、脂肪、肌肉和肝脏中分离得到，在适宜的培养条件下增殖诱导可分化成为中胚层的骨、软骨和脂肪细胞，外胚层的神经细胞及内胚层的肝细胞和肺泡上皮细胞。MSCs具有免疫负调节和修复骨与软骨的作用，因而为类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)的治疗带来了新的前景[1]。有研究发现MSCs可通过阻断淋巴细胞的过度激活发挥对RA的治疗，但也有研究发现MSCs可通过增强滑膜细胞的增殖而加重关节的破坏。这是否与MSCs所处的微环境导致其生物学特性的改变相关呢？为了解MSCs在RA炎性血清及关节液中生物学特性的改变，故做此研究。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂：成人骨髓MSCs成骨诱导分化完全培养基(广州赛业生物科技有限公司)，AnnexinV-FITC试剂盒(广州市长瑞生物技术有限公司)。

1.1.2标本：来源于我院风湿科，符合1987年美国风湿病学会诊断标准，处于活动期的RA患者共12人，其中男性3人，女性9人，平均年龄47.2±13岁。采集外周血5ml，离心后留取上清。其中6位行关节腔穿刺时抽出积液，无菌留取关节液上清。对照组血清为14名健康体检者，其中男性4例，女性8例，平均年龄41.3±10岁。

1.2方法

1.2.1骨髓MSCs的分离培养：采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离、培养骨髓MSCs，传至第三代用于后续试验。

1.2.2RA炎性血清对MSCs增殖的影响：将MSCs以相同的细胞数(约4000个)加入96孔板。实验组分别加入10%、30%浓度的RA血清，以加入对应浓度健康者血清为对照组。5天后采用MTT法检测各孔吸光度值(absorbance,A值)。

1.2.3经RA炎性血清作用后的MSCs对T细胞增殖的作用：将MSCs以相同的细胞数(约4000个)接种于96孔板。实验组加入30%RA患者血清，对照组加入相同浓度的健康者血清，每组6个复孔。培养5天后采集活动期RA患者外周血10ml，按试剂盒方法分离纯化CD3+T淋巴细胞。实验组与对照组均各留3孔作为单独MSCs培养组，其余3孔内分别加入100μlT细胞悬液(约104个)，同时设置单独T细胞培养组。并于加有T细胞的孔内各加入植物血凝素5μg，置培养箱内培养3天后，采用MTT法检测各孔A值，并计算MSCs对T细胞增殖的抑制率。

T细胞增殖抑制率＝(MSCs与T细胞共培养组A值-单独MSCs培养组A值)/单独T细胞培养组A值×100%

1.2.4RA炎性关节液对MSCs增殖的影响：将相同数量的MSCs(约4000个/孔)接种于96孔板。实验组分别加入10%、30%和50%浓度的RA患者关节液，设空白对照。5天后采用MTT法检测各孔A值。

1.2.5RA炎性关节液对MSCs成骨诱导分化的影响：将相同的数量的MSCs(约105个)接种于6孔板。实验组加入50%浓度的关节液，对照组不加。5天后加入成骨细胞诱导液诱导，7天后茜素红染色检测形成的钙结节，RT-PCR检测骨桥蛋白基因的表达。

1.3统计学方法

数据采用SPSS13.0软件统计。计量资料用mean±SD表示。两样本均数比较采用t检验，率的比较采用X2检验，多样本均数比较采用方差分析，P<0.05具有统计学意义。

2.结果

2.1MSCs的培养扩增

采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功培养扩增得到MSCs。第三代MSCs形态均匀一致、增殖迅速，用于后续实验。(图1)

2.2RA炎性血清对MSCs增殖的作用

实验组MSCs血清浓度为10%组的A值是0.28±0.04，30%组是0.33±0.09；对照组则分别为0.31±0.01和0.44±0.16。相同浓度的实验组与对照组间的差异没有统计学意义(表1)。

*与对照组相比，t=0.94，P=0.37；**t=1.58，P=0.14

2.3经RA炎性血清作用后的MSCs对T细胞增殖的作用

实验组MSCs的A值为0.53±0.02，与T细胞共培养组为0.71±0.07；对照组MSCs为0.47±0.02，与T细胞共培养组为0.71±0.08。单独T细培养胞组的A值为0.51±0.05。根据公式计算，实验组MSCs对T细胞增殖的抑制率为35%，而对照组为48%。实验组与对照组间的差异没有统计学意义(t=0.42，P=0.72)。

2.4RA炎性关节液对MSCs增殖的影响

关节液浓度为10%的实验组MSCs的A值是0.23±0.07，30%组是0.19±0.07，50%组是0.16±0.05，对照组则为0.25±0.01(图2)，实验组与对照组间的差异没有统计学意义(F=2.38，P=0.092)。实验组内，50%浓度组与10%浓度组之间的差异有统计学意义(P=0.027)。50%浓度的关节液可抑制MSCs的增殖。

MSCs经50%浓度RA关节液作用5天后，成骨诱导1周即可产生更多、更大的钙结节。RT-PCR可见骨桥蛋白基因的表达明显多于对照组(图3)。

M为DNAMarker2000L，1为内参，大小450bp，2、3为实验组，4-6为对照组，目标基因大小361bp。

3.讨论

类风湿关节炎是一种以滑膜关节慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病，主要侵犯外周关节，滑膜病变包括滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、侵蚀性软骨及骨组织损伤，最终将导致关节结构破坏、畸形和功能丧失。此病发病率高，是造成我国劳动力丧失和致残的主要原因之一[2]。病因包括环境、遗传、机体的免疫异常以及性激素分泌的异常，目前具体的发病机制尚不清楚。传统的治疗方法以非甾体类消炎药和改善病情抗风湿药物为主，但其临床缓解率低，而且副作用大。随着生物技术的发展，特异性抑制炎性细胞或细胞因子的生物制剂如TNF-α单克隆抗体Inflixima和TNF-α竞争性抑制剂Etanercept具有抗炎和改善病情的作用。生物制剂的应用使RA的临床缓解率有所提高，但是费用昂贵、易并发感染，且仅能控制或阻止病情进展，当疾病进展至后期关节畸形后，无法修复其骨与软骨的破坏。因而RA的治疗方法有待进一步发展。

间充质干细胞来源广泛，目前采用的密度梯度离心法结合贴壁筛选法获得的细胞形态均一，生长性状稳定，增殖迅速，培养成功率高[3]。MSCs具有弱免疫原性，可以抑制T、B等淋巴细胞的炎症反应，能够分化成为骨和软骨细胞起到修复骨与软骨的作用，为RA的治疗带来了新的应用前景[4]。Andrea[5]等采用完全弗氏佐剂乳化的CⅡ免疫小鼠造出RA的模型，其中一部分在造模的同时就经腹腔内注入同种异体小鼠的骨髓MSCs，结果给予MSCs的小鼠，其RA的发生率及严重性明显低于未给予MSCs者。但是有研究者同样在CIA造模的同时及第21天将MSCs注入小鼠体内，结果证实MSCs并没有发挥治疗作用，反而通过上调基质金属蛋白酶和环氧化酶mRNA的表达，加重病变关节局部的炎症反应和细胞外基质的破坏程度[6]。

MSCs在实验研究中并没有稳定地发挥对RA的治疗作用，这可能与其所处的微环境导致其生物学特性发生改变相关，因为RA患者自身的骨髓MSCs以及从滑膜、滑液中分离出的MSCs数目是减少的，分化成为软骨、成骨细胞和成脂肪细胞的能力是降低的，且新生软骨更易被降解[7-8]。另外，有研究还发现MSCs在体外培养扩增时，表面抗原会随着培养环境的变化而变化，例如趋化因子受体表达的消失带来了趋化功能的丧失，表面粘附分子的消失带来了细胞增殖能力的丧失和细胞凋亡通道的激活。但是本研究发现活动期RA患者的炎性血清并不会引起外源性MSCs的增殖的抑制，也不会降低其对T淋巴细胞增殖的抑制作用。虽然较高浓度的炎性关节液可抑制MSCs的增殖，但同时加快了其向成骨细胞分化的速度。这与Gonzalez[9-10]等在实验中观察到的结果类似。将MSCs与RA病人的T细胞共培养，发现其可抑制RA患者抗原特异的T细胞反应，抑制胶原活化的CD4和CD8细胞的增殖反应和炎性细胞因子的产生。在MSCs处理的情况下，分泌IL-10的T细胞和单核细胞的数目明显增加。最终，MSCs下调了RA病人的炎性反应和滑膜细胞对基质降解酶的产生。MSCs可降低各种炎性因子和趋化因子的产生，降低抗原特异的Th1/Th2细胞比例，诱导淋巴结和关节中抗炎性因子IL-10的产生，同样还能诱可抑制自身反应性效应T细胞反应的调节性T细胞的产生，发挥对RA的治疗作用。因此，如何有效地让MSCs完全发挥对RA的治疗作用尚需进一步研究。

参考文献

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