杭州民生药业有限公司浙江省杭州市311100
前言:由于原质量标准中VD3含量测定方法,含量检测受辅料干扰比较大,而且结果平行性不好,通过新的检测方法检测,发现对含量检测干扰比较小,且平行性较好,回收率高,故建立VD3含量新方法,并对该方法进行方法学验证。
1.验证内容
本次方法学验证包括以下几个方面:方法系统适用性,准确度,精密度,检测限,定量限,线性试验,专属性等。
2.仪器及试药
2.1仪器:Agilent1100
2.2试药:样品:空白辅料(碳酸钙:大豆油=6:4),钙加维生素D软胶囊
对照品:维生素D3(批号10061-0206,中检所)
含量100.0%
试剂:没食子酸(化学试剂)、氢氧化钾(分析纯),无水硫酸钠
石油醚(色谱纯,沸程30℃~60℃),甲醇(色谱级),纯化水
3.方法概述
3.1色谱条件:
流动相:甲醇:水=92:8
进样量:20μl
检测波长:265nm
柱温:30℃
色谱柱:C184.6×250mm5μm
3.2测定法:
焦性没食子酸的乙醇溶液:15g/L
氢氧化钾溶液:质量比为50:50
3.2.1样品处理
准确称取10g样品内容物,置于250ml平底烧瓶中,加30ml蒸馏水。
3.2.2测定液的准备
3.3.2.1于上述处理的样品溶液中加入100ml的没食子酸溶液,充分混匀后加50ml氢氧化钾溶液,在蒸汽浴上连续回流30min后,立即冷却到室温。
3.2.2.2将皂化液转入一500ml分液漏斗中,用100ml水分几次冲洗平底烧瓶,洗涤液并入分液漏斗中。
3.2.2.3于上述分液漏斗中,加入100ml石油醚,盖好瓶塞,倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中,注意释放瓶内压力。静置分层,将水相放入另一500ml分液漏斗中。重复上述萃取过程二次,合并石油醚到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性,通过无水硫酸钠过滤干燥,在40℃和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近干(绝不允许蒸干)后,加石油醚适量,用氮气将瓶中石油醚吹干,精密加入甲醇10ml,超声助溶,0.45μm偏氟膜滤过,即得样品溶液。
3.2.3对照品溶液制备:
精密称取维生素D3对照品25mg于100ml量瓶中,用甲醇溶解至刻度,摇匀;精密移取1ml该溶液于100ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀;作为对照品溶液。
4.系统适应性
4.1标准:连续进样的相对标准偏差应不大于2.0%。
4.2操作步骤:取对照品溶液连续进样5次,记录色谱图,计算相对标准偏差。
结果见下表:
结论:系统适应性试验结果符合规定。
5.方法专属性
5.1对照品溶液:精密称取VD3对照品约25mg于100ml量瓶中,加甲醇适量使之溶解,定容至刻度,精密移取1ml于100ml量瓶中,甲醇定容至刻度。取20μl进样。
5.2空白:取20μl甲醇进样。
5.3空白辅料:同样品同步处理,取20μl进样。
5.4光破坏:取该溶液适量,于日光下照射破坏,取20μl进样。
5.5热破坏:取该溶液适量,于100℃水浴中破坏,取20μl进样。
5.6VD2溶液:精密称取VD2对照品约25mg于100ml量瓶中,加甲醇适量使之溶解,定容至刻度,精密移取1ml于100ml量瓶中,甲醇定容至刻度。摇匀,取20μl进样。
5.7结论:专属性试验图谱见附图2。
6.方法精密度
6.1精密度试验
取供试品溶液连续进样6针,以峰面积计算,RSD%≤2.0%。
结论:供试品溶液精密度试验结果符合规定。样品重现性良好。
7.方法准确度
7.1回收率试验
精密称取维生素D3对照品20mg,25mg,30mg各3份于100ml容量瓶中,加甲醇适量使之溶解,定容至刻度,得对照液(1);精密移取1ml于100ml量瓶中,甲醇定容至刻度,得对照液(2)。
测试液制备:精密称取空白辅料约10g,置250ml平底烧瓶中,精密加入10ml对照液(2),加30ml蒸馏水。再加入100ml的没食子酸溶液,充分混匀后加50ml氢氧化钾溶液,在蒸汽浴上连续回流30min后,立即冷却到室温。将皂化液转入一500ml分液漏斗中,用100ml水分几次冲洗平底烧瓶,洗涤液并入分液漏斗中。于上述分液漏斗中,加入100ml石油醚,盖好瓶塞,倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中,注意释放瓶内压力。静置分层,将水相放入另一500ml分液漏斗中。重复上述萃取过程二次,合并石油醚到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性,通过无水硫酸钠过滤干燥,在40℃和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近干(绝不允许蒸干)后,加石油醚适量,用氮气将瓶中石油醚吹干,精密加入甲醇10ml,超声助溶,0.45μm偏氟膜滤过,即得样品溶液。
结果下表:
结论:含量结果符合规定。
8.线性及范围
溶液配制:精密称取维生素D3对照品约25mg于200ml量瓶中,加甲醇适量使之溶解,定容至刻度。分别移取该溶液1.0ml,1.5ml,2.0ml,2.5ml,3.0ml,,于100ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀;分别精密量取上述溶液各20μl注入色谱仪,记录色谱图。结果以峰面积为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X)作回归方程如下:
结果:维生素D3在1.25~3.75μg/ml范围内峰面积(mAU)与浓度(μg/ml)线性关系良好,回归方程为Y=57.082X+0.516,相关系数r=0.9992。
9.检测限和定量限
9.1检测限
9.1.1标准:信噪比>3
9.1.2操作步骤:取标准溶液逐步稀释至一定体积,测定每种溶剂的最小检测限。当峰高为基线噪音的3倍时的浓度,即为检测限。
9.2定量限
9.2.1标准:信噪比>10
9.2.2操作步骤:取标准溶液逐步稀释至一定体积,测定每种溶剂的最小定量限。当峰高为基线噪音的10倍时的浓度,即为定量限。
9.3结果:测得维生素D3检测限浓度为0.0375μg/ml,定量限浓度为0.15μg/ml。(图谱见附图7)
10.讨论
验证方案中建立的钙加维生素D3中维生素D3含量的测定方法,辅料干扰小,方法重现性好,回收率符合规定,专属性强,可作为该制剂质量控制方法。
作者简介:乐嘉平男1981年7月12日杭州民生药业有限公司工程师药物制剂方向