高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀的血药浓度

高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀的血药浓度

何安阳陈惠龙

何安阳陈惠龙（福建省泉州市第一医院362000）

【中图分类号】R965.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）23-0215-02

【摘要】目的建立高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀血药浓度的方法。方法采用纯乙腈超声提取，高速离心沉淀蛋白后，以乙腈-乙酸铵缓冲液作为流动相，PhenomenexLuna3μC18(2)100A(150×2.00mm3μm)反相色谱柱，在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱进行测定。结果血浆中阿托伐他汀的线性范围为0.1-20ng/mL，定量限为0.1ng/mL。方法回收率为96%～103%，日间、日内RSD均小于6%。结论本方法简单、灵敏、准确，适用于阿托伐他汀人体血药浓度的检测。

【关键词】阿托伐他汀血药浓度高效液相色谱—串联质谱法（LC-MS/MS）

阿托伐他汀钙片是他汀类血脂调节药，为3-羟基-3-甲基一戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂[1]，它能够降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，减少低密度脂蛋白的生成，临床上用于家族性高胆固醇血症、混合性高脂血症等症。因其降脂作用强，副作用小，在高脂血症，特别是高胆固醇血症的治疗中得到广泛应用[2]。本文建立了高效液相色谱—串联质谱法测定血浆样品中的阿托伐他汀，本法专灵敏度高、重现性好，样品处理方法简便。化学结构见图1。

图1阿托伐他汀的结构式

Fig.1StructureofAtorvastatin

1实验部分

1.1材料和试剂

阿托伐他汀标准品购自中国药品生物制品检定所；前处理所用乙腈为分析纯，流动相的乙腈为色谱纯（德国MERCK）；实验用水为超纯水，由Milli-Q系统制作（美国Millipore公司）。

1.2液相色谱条件

液相色谱仪器为岛津ProminenceUFLC；色谱柱选用PhenomenexLuna3μC18(2)100A(150×2.00mm3μm)；柱温40℃；流动相：乙腈—乙酸铵缓冲液（乙酸铵5mmol／L、甲酸0.5％（v/v））（体积比6：4），等度洗脱；进样量10μL；流速保持在0.3mL/min。

1.3质谱条件

质谱仪器为美国AB公司的API4000Q-trap；电离方式：ESI（+）；选择多重反应监（MRM）；电离电压5500V，辅助加热温度500℃，气帘气30psi，雾化气3psi，碰撞气：中等，离子源气体1：50psi，离子源气体2：60psi。阿托他汀在ESI（+）[M+H]+的MRM模式下的质谱参数见表1。

1.4血浆样品处理

精确量取血浆样品0.5mL于10mL离心管中，准确加入2.5mL乙腈，涡旋2min后，超声10min，在4500r/min转速下离心5min。移取上清液用氮气吹干，用1mL的50%乙腈水定容，过0.22μm滤膜，供LC-MS-MS分析。

表1阿托伐他汀在ESI（+）[M+H]+的MRM模式下的质谱参数

Table1TestparametersforAtorvastatininMRM

＊定量离子对(quantitativeionpair)

2结果与讨论

2.1方法的线性范围、相关性及检出限实验

以在血浆空白样品基体中六点添加标准品法制作校正曲线,7点添加水平分别是0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。按本文方法进行加标回收试验，结果表明，方法此范围内线性相关，相关系数r=0.9998，当信噪比S/N≥10时，定量下限LOQ为0.1ng/mL。

2.2方法的精密度和回收率

取空白血浆，分别精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，配制成浓度为0.2ng/mL、2ng/mL.10ng/mL的血浆样品各6份，按1.4步骤处理在同日内重复测定5次，并连续5天测定，计算日内、日间的精密度。得到的日内精密度（RSD%）分别为2.62、3.11、1.97，日间精密度分别为3.55、5.65、4.98。阿托伐他汀0.2ng/mL、2ng/mL、10ng/mL三个水平浓度的测定回收率结果见表2。

表2空白血浆阿托伐他汀的添加回收率和精密度(n=6)

Table2RecoveriesandprecisionsofAtorvastatinatdifferentfortifiedlevels(n=6)

2.3稳定性试验

取空白血浆．精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，分别配制成浓度为0.5ng/mL和2ng/mL血浆溶液，按“1.4”项下血浆处理方法操作，分别于0、2、4、8、10h时进行色谱分析，记录峰面积。结果，RSD分别为3.56％和4.14％。表明样品血浆溶液在10h内稳定。

图2阿托伐他汀在MRM条件下二种离子的谱图

Fig.2TwoionchromatogramsofAtorvastatininMRM

2.4实验条件的优化讨论

试验中比较了甲醇—乙酸铵缓冲液、乙腈—乙酸铵缓冲液、甲醇—水和乙腈—水[3-6]四种流动相体系，结果表明，以乙腈—乙酸铵缓冲液作为流动相得到的峰型最好，出峰时间也较稳定。这可能由于水相中甲酸提高了待测物在ESI正离子电喷雾中的离子化效率，乙酸铵则使检测物出峰时间较为稳定。因此本文选择用乙腈—乙酸铵缓冲液作为流动相，得到的谱图峰形的对称、出峰时间和灵敏度均较理想（见图2）。

参考文献

[1]赵冰.阿托伐他汀的临床研究进展[J].中国药房，2010,21(24):203-204.

[2]PloskerGL，WagstafAJ．Fluvastatin：areviewofitspharmaeologyanduseinthemanagementoghypereholesterolaemia[J]．Drugs,1996,51:433.

[3]姜楠，杨永革，许雪廷，等.LC-MS-MS法测定人血浆中阿托伐他汀浓度[J].药学实践杂志2011,29(1):15-17.

[4]胡晓玲，李环德．UPLC-MS／MS法测定健康人血浆中的阿托伐他汀浓度及药物代谢动力学研究[J].中南药学，2008，6(4)：400.

[5]TatarS,AtmacaS．Determinationofamlodipineinhumanplasmabyhigh—performanceliquedchromatographywithfluorescencedetection[J]．JChromatogrBBiomedSciAppl,2001,758(2):305-310.