白藜芦醇对胆管癌细胞增殖及p21和p27蛋白表达的影响

白藜芦醇对胆管癌细胞增殖及p21和p27蛋白表达的影响

刘永钱华翔卓玛徐建忠

刘永钱华翔卓玛徐建忠(苏州大学附属常州肿瘤医院肿瘤内科213001)

【中图分类号】R969.4【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）52-0091-03

【摘要】目的研究白藜芦醇对胆管癌细胞QBC939增殖的影响，探讨其可能的分子机制。方法MTT比色法检测白藜芦醇对胆管癌细胞QBC939增殖的影响；Westernblotting法检测白藜芦醇对p21和p27蛋白表达的影响。结果白藜芦醇对胆管癌QBC939细胞的增殖具有明显抑制作用，其抑制作用呈浓度和时间依赖性（P<0.05）；白藜芦醇明显上调p21和p27蛋白的表达，并呈浓度依赖性（P<0.05）。结论白藜芦醇能明显抑制胆管癌QBC939细胞的增殖，其机制可能与调节p21和p27的表达，对细胞周期进行负向调节有关。

【关键词】白藜芦醇胆管癌增殖p21p27

胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，因其所处的解剖位置比较特殊，容易向周围组织、血管、神经浸润，所以外科手术切除率低，仅为10％～40％。无法手术的进展期胆管癌患者的预后极差，总生存期仅6～8个月[1]。由于胆管癌诊断困难、侵袭性强，而且对化疗和放疗不敏感[2,3]，因此寻找新的有效治疗途径并改善其预后有着重要意义。白藜芦醇（Resveratrol）是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要存在于虎杖、葡萄、花生、桑椹、松树等70多种植物中[4]，具有抗炎、抗氧化、调节血脂、抑制血小板聚集、保护心血管、抗肿瘤等多种功效，这其中抗肿瘤作用最引人注目。近年来研究证明白藜芦醇对肿瘤的起始、促发、进展3个阶段均有抑制作用[5]，可以抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的生长，促进其凋亡[6-8]。本实验观察白藜芦醇对胆管癌细胞QBC939增殖的影响，并检测p21和p27蛋白表达的变化，初步探讨其可能的分子机制，为临床应用白藜芦醇治疗胆管癌提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

白藜芦醇（美国Sigma公司），高糖DMEM培养液（美国Thermo公司），胎牛血清（无噬菌体级别，杭州四季青），青霉素-链霉素溶液（100x，Gibco公司），MTT（南京生兴生物），兔抗大鼠p21单克隆抗体（美国Millipore公司），兔抗大鼠p27单克隆抗体（美国CST公司），小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（博士德公司），羊抗兔IgG-HRP（博士德公司），羊抗小鼠IgG-HRP（博士德公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Biosharp公司），ECL显色剂（Pierce公司），医用x射线胶片（柯达公司），凝胶图象分析系统（天能GIS-2010）。

1.2方法

1.2.1细胞和细胞培养人胆管癌细胞株QBC939购买自中南大学湘雅医学细胞中心，培养基为含10%胎牛血清的高糖DMEM，加入青霉素（100kU/L）和链霉素（100mg/L），在37℃含5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，1～2天传代1次。实验均在细胞对数生长期内进行。

1.2.2MTT法检测细胞增殖将QBC939细胞悬液调整为1×105/ml，接种于96孔板，每孔200μl，24h后，用无血清的培养液同步化24h，换为完全培养基，加入0（仅加入完全DMEM培养液，作空白对照组）、25、50、100μmol/L白藜芦醇各20μl，继续培养24和48h，每孔加5mg/mlMTT20μl，37℃作用4h，弃上清，加150μlDMSO，避光震荡5min。用全自动酶标仪测490nm处的吸光度（A值）。细胞抑制率（%）=（1-实验组A值/空白对照组A值)×100%。

1.2.3Westernblotting法检测p21和p27蛋白表达收集不同浓度白藜芦醇（25、50、100μmol/L）作用24h后的QBC939细胞，及对照组QBC939细胞，每皿加蛋白裂解液500μl和蛋白酶抑制剂（PMSF）10μl，在冰上裂解30min后，用细胞刮棒刮下细胞，4℃，12000rpm/min离心10min，取上清移于EP管中，BCA法测定各组蛋白浓度。每组按50μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳，β-actin、p21、p27分别用150mA恒流转膜30min至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，加一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗一抗，加二抗室温孵育1h，TBST漂洗二抗。暗室内加入ECL发光液，X光片感光，显影，定影，数码照相。计算机图像分析系统计算单位面积吸光度积分，进行定量分析。

1.3统计学分析

结果以均数±标准差（x-±s）表示，采用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（OnewayANOVA），两组均数之间比较采用q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1白藜芦醇对细胞增殖的影响白藜芦醇可抑制胆管癌QBC939细胞的增殖，其抑制作用呈浓度和时间依赖性。随着白藜芦醇浓度增加，细胞生长抑制率也增加（P<0.05）。随着白藜芦醇干预时间的延长，抑制率也增加（P<0.05）。见图1。

注：各干预时相组间比较，＃P<0.05；各浓度间比较，＃＃P<0.05。

图1MTT检测不同浓度白藜芦醇对人胆管癌细胞QBC939的抑制率

2.2白藜芦醇对胆管癌细胞QBC939的p21和p27蛋白表达的影响用不同浓度白藜芦醇干预胆管癌细胞QBC939，采用Westernblotting法检测干预24小时后的蛋白表达情况，p21和p27蛋白表达均明显上调，呈浓度依赖性（P<0.05）。见图2。

注：与对照组比较，＃P<0.05

图2白藜芦醇对胆管癌细胞QBC939的p21和p27蛋白表达的影响

3讨论

白藜芦醇是近年来较受关注的天然抗肿瘤化合物，被认为是最有希望的化学防癌剂和化学治疗药物之一。白藜芦醇抗肿瘤的确切机制尚不完全明确，研究认为可能与抑制细胞DNA合成、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、干扰细胞信号传导通路、抗肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞转移等途径有关[9]。白藜芦醇已被证实对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用[6-8]，但其在胆管癌中的研究报道很少。本实验研究证实白藜芦醇可抑制胆管癌QBC939细胞的增殖，且抑制作用呈浓度和时间依赖性，随着白藜芦醇浓度增加和干预时间的延长，其抑制胆管癌QBC939细胞增殖的效应也增强。这一结果与Roncoroni[10]等的报道相类似，提示白藜芦醇在胆管癌治疗领域具有良好的前景。

细胞周期是指细胞完成生长、分裂形成2个子细胞的全部过程，是由激活的各种蛋白复合物启动的一系列细胞活动，顺序分为G1期、S期、G2期、M期4个连续时相。肿瘤细胞的最基本特征就是细胞周期调控机制的破坏，导致细胞的失控性生长。在细胞周期中起调节作用的重要蛋白包括起正向调节作用的细胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependentkinases，CDKs），以及起负向调节作用的周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKinhibitor，CKI）。p21和p27同属CIP-KIP家族，均为对细胞周期起负调控作用的CKI成员。p21可抑制多种Cyclin-cdk复合物的活性，将细胞周期停滞在G1期，还可阻断细胞增殖核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）活化，抑制DNA的合成，阻断细胞周期进程。p27主要通过对CDK的抑制作用，阻断G1到S期的转换。因此p21和p27表达或功能的缺失被认为与人类多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[11]。国外学者Benitez[12]等的实验发现白藜芦醇能增强前列腺癌细胞p21和p27蛋白的表达，从而阻滞细胞周期。本研究表明，白藜芦醇能使胆管癌QBC939细胞p21和p27蛋白的表达上调，并呈浓度依赖性。因此我们认为白藜芦醇可通过调节p21和p27等CKI的表达，对胆管癌QBC939的细胞周期起负向调节作用，从而抑制细胞增殖，起到拮抗肿瘤的效果。

由于胆管癌恶性程度高，手术切除率低，现有药物治疗的效果较差，因此寻找新的疗效确切且毒副作用小的治疗方法显得尤为重要。本研究结果显示白藜芦醇可抑制胆管癌QBC939细胞的增殖，并通过上调p21和p27蛋白的表达调控其细胞周期，发挥抗肿瘤效应。这为白藜芦醇应用于胆管癌的临床治疗提供了实验依据，有必要进行更深入的探索性研究。

参考文献

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