微小RNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织上的表达及与磷酸酶张力蛋白基因的相关分析

微小RNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织上的表达及与磷酸酶张力蛋白基因的相关分析

邓苏辛1唐艳2

1.衡阳市中心医院衡阳421001；2.南华大学第一附属医院

【摘要】目的：探讨微小RNA-21（microRNA-21）和第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（PTEN）在低温条件下心力衰竭的心肌组织上的表达情况及其相关性。方法：利用阿霉素及气候箱模拟低/常温条件下心力衰竭大鼠模型，以心功能、心肌组织凋亡率及病理改变作为心力衰竭建模成功的观察指标。采用定量荧光PCR（qRT-PCR）检测低/常温条件下心力衰竭及与其对应的低/常温条件下正常的心肌组织上的microRNA-21及PTENmRNA表达，Westernblot法检测相应心肌组织中PTEN蛋白表达，分析在低温条件下心力衰竭大鼠心肌组织中microRNA-21及PTEN表达的相关性。结果：低温条件下心力衰竭的大鼠的心功能及心肌组织凋亡率明显高于常温条件下心力衰竭的大鼠；低温条件下正常大鼠的心功能及心肌组织凋亡率与常温条件下正常大鼠的无明显差异性。microRNA-21在常温条件下心力衰竭的心肌组织中表达高于常温条件下正常心肌组织；microRNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织中表达明显高于常温条件下心力衰竭的心肌组织；PTEN在常温条件下心力衰竭的心肌组织中表达低于常温条件下正常心肌组织；PTEN在低温条件下心力衰竭的心肌组织中表达明显低于常温条件下心力衰竭的心肌组织；microRNA-21的高表达还和较高心肌组织凋亡指数和较低的心功能有关。结论：microRNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织上的差异性表达，PTEN可能为microRNA-21在低温条件下心力衰竭的靶基因之一，可能在低温条件下心力衰竭的发生发展中起重要作用。

【关键词】低温条件；microRNA-21；PTEN；心力衰竭

随着环境的变化，恶劣气候等自然灾害已经成为严重威胁人类健康重要因素，其中由于低温不但可以通过过度兴奋交感神经引起心肌负荷加重，而且还可以直接引起心肌细胞凋亡，特别是对已有基础心脏疾病的患者，是恶劣环境导致死亡的主要因素之一。对心血管及呼吸道疾病的发病率起着重要的作用，日昼夜温差每增加1℃，心力衰竭及哮喘的发病率各增加3%和1.1%。然而，目前对低温条件下心力衰竭的概念一直不是很清晰，关于其病理生理分子机制和诊治的研究迄今为止在国内外仍未正式开展。microRNA是真核生物中一种长度约为22个核苷酸大小、参与基因转录后调控的非编码单链小分子RNA，可特异性识别靶mRNA的3’-非编码区（3’-UTR）并与之结合，从而降解靶mRNA、抑制翻译，发挥其对基因的转录后表达调控，调节重要的细胞活动，参与众多心血管疾病的病理生理过程[3-4]。其中microRNA-21在许多心血管疾病如心肌梗死[5]、心力衰竭[6]、心脏肥大上均呈差异性表达，参与各种心血管疾病的病理生理分子机制。近年来研究发现microRNA-21对外界温度的变化相当敏感，外界温度的变化可能会对microRNA-21的表达产生影响。但目前关于microRNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织上表达量的变化尚不清楚。microRNA-21介导的心血管效应的靶基因有四个，分别是程序性细胞死亡因子4（PDCD4），磷酸脂酶-张力蛋白同源物（PTEN），sprouty1（SPRY1）和sprouty2（SPRY2）。这四个靶基因具有明显细胞和条件特异性[7]。Sayed等[8]发现PTEN是在低氧诱导的心肌细胞凋亡上的microRNA-21的靶基因，Roy等人[9]研究发现PTEN是在小鼠缺血/再灌注诱导的心脏重构的心脏成纤维细胞上的microRNA-21的靶基因。YangQ[10]等发现曲美他嗪能通过激活PTEN/AKT信号通路上调microRNA-21的表达从而抑制缺血再灌注导致的心肌损伤。但microRNA-21在低温条件下心力衰竭上是否通过PTEN起作用未见报道，因此，本研究利用阿霉素及气候箱模拟低/常温条件下心力衰竭大鼠模型，以心功能、心肌组织凋亡率及病理结构改变评价心力衰竭严重程度。同时检测心肌组织上的microRNA-21及PTENmRNA及蛋白表达，分析在低温条件下心力衰竭大鼠心肌组织中microRNA-21及PTEN表达的相关性，探讨microRNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织上的作用及可能的机制。

1.材料与方法

1.试验动物：成年雄性SD大鼠52只，体重（250～270g）。

2．主要试剂及仪器：阿霉素（美国sigma公司），β-actin鼠抗多克隆抗体（SantaCrusz公司），总RNA提取试剂Trizol（1nvitrogen公司），qRT-PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司），TUNEL试剂盒（美国promega公司），PTEN的兔抗多克隆抗体（Abcam公司）。）

3.心力衰竭动物模型制备及分组：雄性SD大鼠52只，喂养3d后随机分为常温正常组，低温正常组，常温心衰组和低温心衰组，每组13只，常温心衰组和低温心衰组采用腹腔注射阿霉素造模，阿霉素的量2.5mg/kg/次，每周注射2次，共5周，常温正常组和低温正常组同时腹腔注射等体积生理盐水。所有组放在常温条件下（25℃-28℃）5周，5周后低温正常组和低温心衰组放置于气候箱中（4℃，3小时；重复4天），常温正常组和常温心衰组仍放置于常温条件下（25℃-28℃）。最后一天行心脏彩超检查及HE组织病理检测，Tunel法测心肌细胞凋亡，荧光定量PCR测心肌组织中microRNA-21、PTENmRNA的表达，Westernblot检测大鼠心肌组织中PTEN蛋白的水平。

4.超声心动图检查：选用GEvivid7彩色多谱勒超声诊断仪，高频探头（12MHz），Gain50dB，深度2.5cm。于造模最后一天，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于木板上，胸部脱毛，接心电图，取大鼠胸骨旁左室长轴切面测量左室舒张末径（LVIDd）、左室收缩末径（LVIDs）、射血分数（EF）、缩短分数（FS）。

5.组织学检查：超声检查完毕后，戊巴比妥过量麻醉处死大鼠，取出左室心肌部分，以10％甲醛固定，常规石蜡包埋，病理切片，将切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水，一半用于Tunel法检测心肌组织凋亡率，一半用于HE染色，光镜下观察。

6.Tunel法检测心肌组织凋亡率：实验步骤严格按照Tunel检测试剂盒说明书进行。每只大鼠（光镜下）观察4张切片，每张切片在40倍视野下，随机计数5个不同视野的凋亡细胞及细胞总数，计算凋亡细胞数占总细胞的百分率，取其平均值为凋亡指数（AI）。

7.．组织总RNA提取和qRT-PCR：取100mg左右的心肌组织，依据产品说明书用Trizol裂解，氯仿抽提总RNA。microRNA及内参U6逆转录反应合成模板cDNA，条件为37℃60min、37℃60min、-20℃保存。以20ul反应体系进行PCR，取2ul逆转录反应产物分别与microRNA-21引物和内参照U6引物进行反应。反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s。重复40次循环。PTEN及内参β-actin逆转录反应合成模板cDNA，条件为65℃5min、42℃60min、70℃5min、-80℃保存。以25ul反应体系进行PCR，取2ul逆转录反应产物分别与PTEN及内参β-actin引物进行反应。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s。重复40次循环。在ABIPRISM7500REALTIMEPCRSystem上操作反应，检测microRNA-21及PTEN的相对表达量。

8．组织总蛋白提取和Westernblot：组织经匀浆器研碎后，依据产品说明书用蛋白裂解液RIPA（用前加入10-苯甲基酰氟PMSF）裂解，并用细胞刮收集，4℃，12000rpm离心15min获得总蛋白。取10ul蛋白溶液在聚丙烯酰胺凝胶上电泳先恒压80V，待溴酚兰前沿进入分离胶后约10min，将电压调至120V，恒压，待溴酚蓝电泳直至接近达到分离胶底部关闭电源，0.8-3.0mA/cm2，恒流1-2h转膜。5％脱脂奶粉／TBS-T封闭37℃30-60min。1：400兔抗PTEN、1：1000鼠抗β-actin多克隆抗体4℃过夜，TBS-T（Tris-Base2.42g，NaCl8g，Tween201ml，pH7.6）洗膜10min，共3次；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗4℃孵育4h，TBS-T洗膜10min，共3次。ECL发光试剂盒显色、显影，显色结果用BIO-RAD数码图像处理系统拍照并分析，蛋白质含量用PTEN蛋白／β-actin蛋白灰度值比表示。

9．统计学处理：数据均以x+-s表示。采用SPSS12.0统计分析软件包做多组间单因素方差分析，各组间两两比较采用SNK检验。以P<0．05为差异有统计学意义。

2.结果

1.各组心脏彩超的表现：与常温条件下正常组相比，常温条件下心力衰竭组LVIDd、LVIDs明显增加（P<0．05），FS明显降低（P<O．05）。而低温条件下心力衰竭组相比常温条件下心力衰竭组LVIDd、LVIDs进一步增加（P<0．05），FS、EF进一步降低（P<O．05）提示低温恶化心力衰竭的进展，心功能进一步降低。低温条件下正常组的LVIDd、LVIDs、FS、EF与常温条件下正常组相比无明显差异性，无统计学意义（P>0．05），结果见表1、图1A。

表1各组心功能情况

图1B检测低温条件下心力衰竭的大鼠的心功能及心肌组织凋亡率.

A：心脏彩超检测各组心功能.B：病理HE染色检测各组心肌组织凋亡率（Bar=20μm）.C：TUNEL法检测各组心肌组织凋亡率（Bar=20μm）.注：*p<0.05与a组比较；a.a组：常温条件下正常大鼠；b组：低温条件下正常大鼠；c组：常温条件下心力衰竭大鼠；d组：低温条件下心力衰竭大鼠。

3.Tunel检测各组心肌组织的凋亡率：光镜下可见常温条件下正常组和低温条件下正常组偶见Tunel阳性细胞，常温条件下心力衰竭组可见明显Tunel染色阳性细胞，低温条件下心力衰竭组可见更多Tunel染色阳性细胞见图3。常温条件下心力衰竭组和低温条件下心力衰竭组A1分别为23.56±2.2、28.79士3.1，均显著高于常温条件下正常组和低温条件下正常组的3.56±1.21和4.21±0.88（P<O．05），常温条件下心力衰竭组AI又显著高于低温条件下心力衰竭组（P<O．05）。常温条件下正常组和低温条件下正常组A1无明显差异，无统计学意义（P>0．05），结果见图1C。

图1C

4.MicroRNA-21和PTENmRNA在常/低温条件下心力衰竭大鼠的心肌组织上的表达量：各样本反应达到预设荧光信号时，常温条件下正常组miRNA-21和U6循环数值分别为29.88±0．06和16.52±0．03，低温条件下正常组分别为23.71±0．03和16.69±0.04，常温条件下心力衰竭组分别为28.91±0．02和15.73±0.05，低温条件下心力衰竭组分别为21.63±0．03和14.27±0.02；常温条件下正常组PTEN和β-actin循环数值分别为21.21±0．02和19.49±0．03，低温条件下正常组分别为21.75±0．02和20.41±0.05，常温条件下心力衰竭组分别为25.18±0．03和19.58±0.04，低温条件下心力衰竭组分别为23.47±0．02和20.11±0.03，2△△CT法分析结果显示，与常温条件下正常组相比，低温条件下正常组的microRNA-21的表达量明显增加，约16倍（P<0.05）；常温条件下心力衰竭组的microRNA-21的表达量增加，约2倍（P<0.05）；低温条件下心力衰竭组的microRNA-21的表达量增加更明显，约32倍（P<0.05）（见图2）；与常温条件下正常组相比，低温条件下正常组的PTENmRNA的表达量降低，约0.5倍（P<0.05）；常温条件下心力衰竭组的PTENmRNA的表达量降低，约0.7倍（P<0.05）；低温条件下心力衰竭组的PTENmRNA的表达量降低更明显，约0.25倍（P<0.05）（见图3）。

图4检测低温条件下心力衰竭的大鼠心肌组织中PTEN蛋白的表达。

β-actin为PTEN蛋白的内参。a组：常温条件下正常大鼠；b组：低温条件下正常大鼠；c组：常温条件下心力衰竭大鼠；d组：低温条件下心力衰竭大鼠。注：*p<0.05与a组比较；

3.讨论

随着环境的变化，恶劣气候等自然灾害已经成为严重威胁人类健康重要因素，其中由于低温不但可以通过过度兴奋交感神经引起心肌负荷加重，而且还可以直接引起心肌细胞凋亡，特别是对已有基础心脏疾病的患者，是恶劣环境导致死亡的主要因素之一。目前对低温条件下心力衰竭的概念一直不是很清晰，关于其病理生理分子机制和诊治的研究迄今为止在国内外仍未正式开展。本研究通过阿霉素及气候箱模拟常/低温条件下心力衰竭的大鼠模型，以心功能、心肌组织病理变化及凋亡率作为评价心力衰竭的指标，其中低温条件下心力衰竭的大鼠的心功能及心肌组织凋亡率明显低于常温条件下心力衰竭的大鼠的心功能及心肌组织凋亡率，两者有明显统计学差异。microRNA是真核生物中一种长度约为22个核苷酸大小、参与基因转录后调控的非编码单链小分子RNA，可特异性识别靶mRNA的3’-非编码区（3’-UTR）并与之结合，从而降解靶mRNA、抑制翻译，发挥其对基因的转录后表达调控，调节重要的细胞活动，参与众多心血管疾病的病理生理过程[3-4]。目前，已经有上千余种microRNA被发现[10-11]，其中microRNA-21在许多心血管疾病如心肌梗死[5]、心力衰竭[6]、心脏肥大上均呈差异性表达，参与各种心血管疾病的病理生理分子机制。近年来研究发现microRNA-21对外界温度的变化相当敏感，外界温度的变化可能会对microRNA-21的表达产生影响[12-14]。但目前关于microRNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织上表达量的变化尚不清楚。本研究采用qRT-PCR技术检测了低温条件下心力衰竭的心肌组织中microRNA-21的表达，证实了microRNA-21在低温条件下心力衰竭的心肌组织中表达明显上调，可能与低温条件下心力衰竭的心功能、心肌组织病理变化及心肌细胞凋亡率有关，表明其在低温条件下心力衰竭的发生发展中可能起重要的调控作用。microRNA-21介导的心血管效应的靶基因有四个，分别是程序性细胞死亡因子4（PDCD4），磷酸脂酶-张力蛋白同源物（PTEN），sprouty1（SPRY1）和sprouty2（SPRY2）。这四个靶基因具有明显细胞和条件特异性[7]。其中PTEN基因是迄今为止发现的唯一具有蛋白酯酶和磷酸酶活性的抑癌基因，在胚胎发育，细胞生长、分化、凋亡和迁移的调控中发挥重要作用。Sayed等[8]发现PTEN是在低氧诱导的心肌细胞凋亡上的microRNA-21的靶基因。Roy等人[9]研究发现PTEN是在小鼠缺血/再灌注诱导的心脏重构的心脏成纤维细胞上的microRNA-21的靶基因。因此我们有理由假设microRNA-21调控PTEN可能是低温条件下心力衰竭的共同存在的机制。microRNA在转录后水平沉默靶基因的表达是近年来新发现的一种重要的表观遗传调节机制，本研究的实验结果表明在低温条件下心力衰竭的心肌组织中microRNA-21的表达和PTEN蛋白及mRNA的表达呈负相关，提示在低温条件下心力衰竭中，microRNA-21可能通过抑制PTEN的转录和翻译从而调控其表达。本实验的研究结果显示microRNA-21和心肌组织凋亡指数和心功能有关，表明其在低温条件下心力衰竭的发生发展中可能起重要的调控作用。但microRNA-21能否成为低温条件下心力衰竭的新的预后指标及诊治靶点，有待进一步的临床随访及实验研究。

参考文献：

[1]BreitnerS，WolfK，PetersA，etal.Short-termeffectsofairtemperatureoncause-specificcardiovascularmortalityinBavaria，Germany.Heart2014；100（16）：1272-80..

[2]LimYH，HongYC，KimH.EffectsofdiurnaltemperaturerangeoncardiovascularandrespiratoryhospitaladmissionsinKorea.SciTotalEnviron.2012；417-418：55-60.

[3]SiniorakisE，ArvanitakisS，RouliaG，etal.Myocardialdamageafterprolongedaccidentalhypothermia：acasereport.JMedCaseReports.2009；3：8459.

[4]FilsethOM，HowOJ，KondratievT，etal.Post-hypothermiccardiacleftventricularsystolicdysfunctionafterre-warminginanintactpigmodel.CritCare.2010；14：R211.

[5]LuS，XuD.Coldstressaccentuatespressureoverload-inducedcardiachypertrophyandcontractiledysfunction：roleofTRPV1/AMPK-mediatedautophagy.BiochemBiophysResCommun2013；442（1-2）：8-15

[6]SunZ.Cardiovascularresponsestocoldexposure.FrontBiosci，2011；2：495–503.

[7]BartelDP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction.Cell，2004；116：281–97.

[8]PushparajPN，AarthiJJ，KumarSD，etal.RNAiandRNAa--theyinandyangofRNAome.Bioinformation.2008；2：235–7.

[9]RoyS，KhannaS，HussainSR，etal.MicroRNAexpressioninresponsetomurinemyocardialinfarction：miR-21regulatesfibroblastmetalloprotease-2viaphosphataseandtensinhomologue.CardiovasRes，2009；82：21-9.

[10]SayedD，HeM，HongC，etal.MicroRNA-21isadownstreameffectorofAKTthatmediatesitsanti-apoptoticeffectsviasuppressionofFasligand.JBiolChem，2010；285：20281–90.