荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析

荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析

刘少刚1郑华生2林旸2蔡銮端2郑睦畅2

刘少刚1郑华生2林旸2蔡銮端2郑睦畅2

（1汕头大学医学院广东汕头515031)

(2广东汕头市澄海区慢性病防治站广东汕头515800）

【摘要】目的探讨荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性。方法对5例现症麻风患者不同时期和16例多菌型治愈者的44份皮肤组织液样本，同时进行荧光定量PCR检测和做涂片抗酸染色镜检,按荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA结果的拷贝数和对应涂片抗酸染色镜检结果分为阴性(-)、1+、2+、3+、4+、5+、6+进行统计分析。结果32份皮肤组织液涂片阴性样本中,4份样本荧光定量PCR检测阳性,麻风杆菌DNA拷贝数多为103数量级;12份涂片阳性样本中,对应荧光定量PCR检测全部阳性,麻风杆菌DNA拷贝数多为104～105数量级,和涂片阳性程度基本呈正相关，荧光PCR检测阳性率比涂片抗酸染色高，但经统计学分析差异无显著性，（P>0.05）。结论荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度有较好的相关性,可以作为麻风病临床诊断和治疗的实验方法。

【关键词】麻风分枝杆菌荧光定量PCR抗酸染色

【中图分类号】R394【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）13-0015-02

随着基因扩增技术的成熟和推广，荧光定量多聚酶链反应（FQ-PCR）检测病原体被广泛应用于医学各科，为了解荧光定量PCR检测麻风杆菌的情况，比较其拷贝数与传统常规的涂片抗酸染色镜检结果程度的相关性。我们于2010年3月至2012年5月，对汕头市澄海区的5例现症麻风病人的不同时期，以及16位已治愈的多菌型麻风治愈者共44份皮肤组织液样本同时进行荧光定量PCR检测和做涂片抗酸染色镜检,现报告如下。

1资料和方法

1.1研究标本：44份皮肤组织液样本来源于5例麻风现症病人（4例为多菌型，1例为少菌型）的治疗前、治疗半年、治疗1年不同时期和16位多菌型麻风治愈者，取活动性皮损皮损组织液，或眶上、颧部、下颌和耳垂至少2个部位的皮肤组织液。

1.2标本的采集和处理：常规消毒皮肤，检查时戴消毒手套，用左手拇、食两指将患者皮肤捏紧提起，使局部皮肤变白，左手指不要松，然后右手持脱刀切开一个5毫米长，3毫米深的切口，以刀刃刮取组织液，粘于灭菌拭子放入密闭的离心管，冷藏做PCR检测麻风菌DNA用，同时刮取组织液涂在载玻片上，固定做抗酸染色用。

1.3荧光PCR检测麻风杆菌DNA：（1）仪器设备与拭剂：全自动基因扩增仪采用中山大学达安公司的DA7600，麻风杆菌核酸荧光PCR检测试剂盒是美国BioXL公司提供。（2）DNA的提取：按试剂盒的说明，加生理盐水1ml,充分混匀，10000rpm离心5分钟，弃上清。加50μl核酸提取液B，充分混匀。100℃处理10分钟，10000rpm离心5分钟，取上清液4μl做PCR反应。（3）PCR扩增:每个反应管加入26μl试剂（ML-PCRMIX24μl+Taq酶系2μl），加入处理后DNA样本或阳性定量标准品梯度（使用前用阴性质控品将ML-阳性标准品（1×107COPIES/ml）梯度希释10倍、100倍、1000倍，记为1×106COPIES/ml，1×105COPIES/ml，1×104COPIES/ml）和阴性质控品4μl,10000rpm30秒。循环条件：93℃→2分钟，后93℃5秒→56℃45秒，共40个循环。（4）结果分析判定：保存数据，调节标准曲线至最佳，仪器自动分析计算出未知标本数值。

1.4涂片抗酸染色镜检：（1）染色：初染：滴加石碳酸复红溶液，小心加热5分钟。脱色：3%盐酸酒精脱色30秒至1分钟。复染：用碱性美兰溶液复染1分钟。（2）油镜观察：麻风杆菌呈红色，常聚集成堆，背景及非抗酸性细菌呈兰色。（3）报告：镜检按以下细菌密度计数。阴性（—）：在200个视野中未查到抗酸杆菌；（1+）：100个视野中有1～10个菌；（2+）：每10个视野中有1～10个菌；（3+）：平均每个视野中有1～10个菌；（4+）：平均每个视野中有10～100个菌；（5+）：平均每个视野有100～1000个菌；（6+）：每个视野中超过1000个菌或大量菌团。

1.5统计学分析：计数资料用χ2检验进行通计分析，以P<0.05为差异显著。抗酸染色镜检结果程度与PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数比较按每个程度对应的DNA拷贝数数量级进行分类分析。

2结果

2.1两种检验方法阳性率的比较

44份标本荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色阳性结果的对比，见表1。

44份标本经荧光PCR检测麻风杆菌DNA阳性为16份，经涂片抗酸染色镜检12份，32份涂片抗酸染色阴性样本中,4份荧光定量PCR检测阳性;12份涂片阳性样本中,12份PCR检测全部阳性，本研究中PCR检测麻风杆菌DNA比涂片抗酸染色阳性率高，但经统计学分析差异无显著性，χ2=0.84，P>0.05。

表1两种检验方法阳性率的比较

两组阳性率比较差异无显著性，χ2=0.84，P>0.05

2.2荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数与对应涂片抗酸染色结果程度的对比

32份涂片抗酸染色阴性样本中,4份样本荧光定量PCR检测阳性,麻风杆菌DNA拷贝数多为103数量级;12份涂片抗酸染色阳性样本中,1用荧光定量PCR检测全部阳性,麻风杆菌DNA拷贝数多为104～105数量级,大多数检测结果DNA拷贝数的数量级随涂片阳性增强而增多，与涂片阳性程度基本呈正相关，具体见表2.

表2涂片抗酸染色结果程度与荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数对比

3讨论

麻风分枝杆菌是一种革兰氏阳性的抗酸杆菌，它的细胞壁内含有大量脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色，而分枝菌酸与染料结合后就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。麻风杆菌传统常规检查方法是涂片抗酸染色镜检，目前仍然是麻风诊断和观察疗效的重要方法。

另外，麻风的超微结构决定了在体外极难培养，迄今麻风菌的体外培养仍未成功，因而建立检测病原菌的方法尤为重要，目前PCR就成为研究麻风分枝杆菌的理想选择。PCR检测麻风杆菌报道不一，有实验证明50%以上未治疗的麻风细菌密度BI阴性病例为基因扩增试验阳性[2]。也有报道[3]MB（多菌型）患者在治疗1个月和6个月时，PCR阳性明显降低，而细菌指数无明显改变。

荧光定量PCR是利用荧光共振能量转移原理，选择荧光基团和淬灭基团对特异性核酸探针作标记，然后根据核酸杂交和核酸分解所致荧光基团和淬灭基团结合和分离而建立[1]，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。与普通PCR不同在于采用闭管，不需pcr后处理，避免污染和假阳性；探针与DNA特异杂交，增强了特异性；可定量；检测结果由光谱分析仪自动显示，增强了灵敏性和客观性。

本试验在于了解用荧光定量PCR检测麻风杆菌方面的情况，主要与涂片抗酸染色镜检作比较，在本研究中，有32份皮肤组织液涂片抗酸染色阴性样本中，4份样本荧光定量PCR检测阳性，在总共44份样本中，荧光定量PCR阳性率为36.4%，比涂片抗酸染色的27.3%高，但经统计学处理后差异无显著性。44份样本平行做荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数和涂片抗酸染色结果程度，经过分析对比，大多数荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数的数量级随涂片阳性增强而增多，与涂片阳性程度基本呈正相关。所以，我们认为荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA可以作为麻风病临床诊断和指导治疗的一种新的实验方法。

参考文献

[1]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社,2010:14-19.

[2]DEWtMYLetal.JClinMicrobiol,1991,29(5):906-910.

[3]Kampirapap,沈建平.DNA扩增用于麻风诊断和评价麻风化疗的疗效[J].国外医学皮肤性病学分册,1999,25(1):62-63.

本研究为汕头市重点科技计划项目：汕府科[2010]63号。