FQ-PCR检测HBVDNA效果分析

FQ-PCR检测HBVDNA效果分析

冯国钢

冯国钢（百色市人民医院检验科广西百色533000）

【中图分类号】R512.6+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）25-0257-02

【摘要】目的检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数，分析乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)与血清免疫标志物的关系。方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清样本中HBV-DNA含量；同时酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBV血清标志物(HBVM)，并对检测结果进行分析。结果在HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)组(大三阳组)和HBsAg(+)HBeAg(+)组HBV-DNA阳性率分别为96.1%（298/310）和96.6%（28/29），病毒含量为：1.85×108copies/ml；HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)组(小三阳组)和HBsAg(+)HBcAb(+)组患者血清HBV-DNA阳性率分别为44.2%(80/181)和82.9%（31/41），病毒含量为：4.8×106copies/ml。血清中HBeAg与HBVDNA含量密切相关。结论荧光定量PCR在乙肝的诊断、判断传染性强弱及评价抗病毒治疗效果方面具有较大的临床应用价值。

【关键词】乙型肝炎病毒荧光聚合酶链反应HBV-DNA

HBV血清标记物检测是乙型肝炎病原学诊断的指标，包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb五项指标，是目前诊断乙型肝炎最常用的指标，临床上常用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，能反映人体对乙肝病毒的免疫状态，但不能直接反映HBV在患者体内的复制与传染情况。外周血中HBV-DNA是诊断乙型肝炎、判断病毒复制、传染性大小和评价药物疗效及预后的重要指标。荧光定量PCR技术以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，近年来在临床检测HBV-DNA中应用广泛且可区分不同的HBV感染状态及评估抗病毒治疗效果[1]。本文采用FQ-PER定量检测561例ELISA法阳性的乙肝患者，旨在提高乙肝患者的诊治水平。现将结果报告如下。

1资料和方法

1.1标本来源：1811例均来自2009年6月至2011年12月我院住院和门诊病人，用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测有561例表面抗原（HbsAg）阳性，其中男性311例，女性250例，年龄16-70岁，平均年龄38岁。诊断符合2000年9月中华医学会传染病与寄生虫病学会分会、肝病学会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”修订的诊断标准[2]。空腹抽血，及时分离血清，－20℃保存，不超过7d进行FQ-PCR。

1.2仪器与试剂：仪器是澳大利亚生产的，型号为Rotor-Gene-3000的扩增仪；FQ-PCR试剂均为上海科华生物公司生产的商品化试剂盒，严格按照说明书进行操作。

1.3方法：用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBV血清学标志，用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测HBVDNA。

1.4荧光定量结果判断标准：HBV-DNA定量以1×103copies/ml为判断阳性标准，＜1×103copies/ml阴性，＞1×103copies/ml为阳性。

2结果

310例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)组（大三阳组）中，HBV-DNA阳性298例，阳性率为96.1%（298/310），29例HBsAg(+)HBeAg(+)组中，HBV-DNA阳性28例，阳性率为96.6%，平均病毒含量为：1.85×108copies/ml；181例HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)组(小三阳组)中，HBV-DNA阳性80例，阳性率为44.2%(80/181)，41例HBsAg(+)HBcAb(+)组中HBV-DNA阳性31例，阳性率为82.9%（31/41），平均病毒含量为：4.8×106copies/ml。血清中HBeAg与HBVDNA含量密切相关。

3讨论

全世界约有3.5亿人感染慢性乙肝病毒，其中三分之一在中国，其HBV感染量居世界首位。定量检测患者血清或血浆HBVDNA病毒已成为监测抗病毒治疗的有效性及预测治疗成功与否的重要手段。荧光实时定量PCR技术在常规的PCR基础上加入荧光素标记的探针，在5′端上标上6-羧基荧光素（Fam），3′端标上6-羧基四甲基碱性蕊香红（Tamre），利用TaqDNA聚合酶5′端水解酶活性，使在延伸是切断5′上Fam，阻断了5′～3′荧光素的能量转移过程，能够检测到Fam所发出的荧光，其荧光强度与其时的产物成正比[3]。许多研究已证明实时定量PCR是一种准确度高、重复性好、灵敏度高而且快速的临床标本HBV水平检测方法,在所有商业化检测方法中检测范围最宽[4]。

本资料结果表明：HBV-DNA在HBV血清学标记物阳性的各种模式中阳性率不一样，HBV-DNA拷贝值也不同。在HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)组(大三阳组)和HBsAg(+)HBeAg(+)组HBV-DNA阳性率分别为96.1%和96.6%，平均病毒含量为：1.85×108copies/ml，表明体内HBV病毒复制活跃，传染性极强。HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)组(小三阳组)和HBsAg(+)HBcAb(+)组患者血清HBV-DNA阳性率分别为44.2%和82.9%，平均病毒含量为：4.8×106copies/ml。说明很多乙肝患者具有强烈的传染性、应阻断传播途径。ELISA测定的是乙肝病毒表达的蛋白质(多肽)抗原或相应的抗体。FQ-PCR测定乙肝病毒DNA。检测HBV-DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”。ELISA方法测定乙肝五项指标依然是辅助诊断乙肝的常规方法,特别对急性乙肝的发现有重要作用。

综上所述，FQ-PCR检测定量HBV-DNA客观地反映了HBV感染、复制及病程变化，特别是在病毒感染早期，ELISA不能检测到低滴度的病毒抗原时，FQ-PCR即可检测到HBV-DNA的复制，有利于乙肝的早期诊断。是病毒复制最直接和可信的指标，特别是定量检测HBV—DNA含量对乙型肝炎的诊断、病情监测、评价抗病毒疗效以及指导用药方面具有重要意义。

参考文献

[1]隋爱华，杨堃，刘相萍.荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床价值[J].医学理论与实践，2009，22（2）：206-207.

[2]中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学会.病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志，2001，19：56-62.

[3]陶志华，陈晓东，王忠永，等.乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR的建立与应用[J].临床检验杂志，2002，20（5）：282-283.

[4]LindhM,HannounC.DynamicrangeandreproducibilityofhepatitisBvirus(HBV)DNAdetectionandquantificationbyCobasTaqmanHBV,area-ltimesemiautomatedassay.JClinMicrobiol,2005,43:4251-4254.