HPLC法测定骨伤一号中羟基红花黄色素A的含量

HPLC法测定骨伤一号中羟基红花黄色素A的含量

郭守芹

郭守芹(内蒙古赤峰市药品检验所内蒙古赤峰024000)

【摘要】目的建立高效液相色谱法测定骨伤一号中羟基红花黄色素A的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，使用C18色谱柱，流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶(24：2：74);流速为1.0ml•min-1，检测波长为403nm。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。结果在0.0525μg～0.4201μg范围内呈良好的线性关系,平均加样回收率为103.16%，RSD为1.50%。结论本方法简便可靠、分离度较好、结果稳定，可用于骨伤一号的质量控制。

【关键词】高效液相色谱法骨伤一号羟基红花黄色素A

骨伤一号是按照中医理论组方的医院制剂。该方由红花、丹参、地黄、续断、当归、桃仁、赤芍、黄柏、防风、甘草十味药组成，功能主治：活血化瘀、通络止痛、消肿。用于骨折初期，骨折局部肿痛较重，可通络消肿止痛，促进骨折愈合。其中红花[1]为方中君药，主要有效成分为羟基红花黄色素A。本研究以羟基红花黄色素A作为对照品建立了骨伤一号蒙药中羟基红花黄色素A的含量测定方法。参照文献[1]羟基红花黄色素A项下的含量测定方法，采用高效液相色谱法对本品中的建立羟基红花黄色素A含量测定方法，通过文献查阅[2-9]，实验摸索确定了比较理想的色谱条件，并经过方法学考察及阴性对照实验，表明该方法操作简单，重现性好，专属性强，方中其它组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。

1仪器

仪器岛津液相色谱仪，包括LC10-ATVP型泵，SCL-10AVP型控制器，SPD-10AVP型检测器,CLASS-VP色谱工作站。普析通用UV-2450型紫外-可见分光光度仪。HR-200型万分之一天平。Presia型十万分之一天平。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱:色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，本实验研究采用DikmaTechnologies迪玛公司-色谱配件专家[Diamonsil(钻石)C18250×4.6mm,5μm]色谱柱。流动相:甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（24：2：74），流速:1.0ml•min-1，检测波长：403nm；进样量:10μl。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取羟基红花黄色素A对照品适量,加25%甲醇制成每1ml中含10μg的溶液,即得。

2.2.2供试品溶液的制备

取本品研细(过三号筛)，取约2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入25%甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率300w,频率50kHz)25分钟。放冷,再称定重量,用25%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3取按处方比例并以相同工艺制备的缺红花的阴性对照，按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。

2.3系统适应性试验取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，照“2.1”项下的色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。从图中可以看出，阴性对照无干扰，待测峰与其他峰分离度良好，羟基红花黄色素A的理论板数不低于3000。

A

B

C

图1阴性对照样品（A）、对照品（B）、样品（C）色谱图

Fig1HPLCchromatogramsofnegtivecontrolsample(A),referencesubstance(B),sample(C)

1羟基红花黄色素A(HydroxysaffloryellowA)

3方法学考察

3.1线性关系考察

取羟基红花黄色素A对照品11.44mg（批号：111637-200905），置100ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀,精密吸取2.5ml、5.0ml、10.0ml、15.0ml、20.0ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各取10μl进样，按上述色谱条件测定，以峰面积对进样量进行回归分析，结果在0.0525μg～0.4201μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=6299874X＋6274，r=0.9999。

3.2精密度试验

精密吸取同一羟基红花黄色素A对照品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积积分值，计算其RSD为0.6%。

3.3稳定性试验

取同一份供试品溶液，精密吸取10μl，分别于0h、4h、8h、12h、16h测定羟基红花黄色素A峰面积，计算其RSD为1.16%。

3.4重复性试验

精密称取20090301批号的样品6份，同法制成供试品溶液，测定。结果羟基红花黄色素A含量为0.20mg•g-1,RSD为0.60%。

3.5回收率试验：

精密称取羟基红花黄色素A21.98mg（批号：111637-200905）置100ml量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。然后取同一批样品6份，各约1.25g，精密称定，分别置6个具塞锥形瓶中，精密加入上述对照品液5ml，精密加入25%甲醇20ml,再按“2.2.2”项下的方法，按上述色谱条件进行测定，计算回收率为103.16，RSD为0.90%。

4样品测定

取本品按“2.2.2”项下的方法处理制成供试品溶液，并在上述色谱条件下进行测定，样品的含量测定结果为20090301为0.20mg•g-1，20090502为0.19mg•g-1，20090802为0.21mg•g-1。

5讨论

5.1提取溶剂的选择

羟基红花黄色素A易溶于水、乙醇[1,6,7]，参照文献[5,8,9]，选择用甲醇作为提取溶剂。

5.2提取时间的选择

分别考察了超声提取25min、30min、45min不同时间对提取效率的影响，结果表明超声提取25分钟可以提取完全。

参考文献

[1]ChP(中国药典).2010.VolⅠ（一部）：141.

[2]YANGRi-li(杨日丽)，LIUJing(刘静).StadyondeterminationofsaffloryellowAincarthamustinctoriusL.byHPLC(HPLC法测定红花中羟基红花黄色素A含量的研究).Guangdongchemicalinduastry(广东化工)，2007,34(7):112-114.

[3]WANChun-ping(万春平)，BAOZhao-rigetu(包照日格图)，QUELing(却翎)etal.TheresearchprogressofCarthamustinctoriusL(红花的研究进展).LishizhenMedMaterMedRes(时珍国医国药)，2007,18(11):2854-2855.

[4]ZHANGHong-yan(张红艳)，SUNHong-sheng(孙洪胜)，FUChun-sheng(傅春升).TheresearchprogressofCarthamustinctoriusLanditscompoundpreparation(红花及其复方制剂的研究进展).ChinaPharmacist(中国药师)，2010,13(7):1033-1034.

[5]ZHAOMing-bo(赵明波)，DENGXiu-lan(邓秀兰)，WANGYa-ling(王亚玲)etal.DeterminationofHydroxysafflorYellowAinCarthamustinctoriusLbyHighPerformanceLiquidChromatography（高效液相色谱法测定红花中的羟基红花黄色素A）.ChineseJournalofChromatography(色谱)，2003,21(6):593-595.

[6]LIUYu-ming(刘玉明)，YANGJun-shang(杨峻山)，LIUQing-hua(刘庆华)etal.StudiesonChemicaConstituentsfromtheCarthamustinctoriusL(红花的化学成分研究).JorunalofChineseMedicinalMaterials(中药材)，2005，28(4):289.

[7]JIANGJian-shuang(姜建双),XIAPeng-fei（夏鹏飞），FENGZi-ming（冯子明）etal.ChemicaConstituentsfromtheCarthamustinctorius(红花化学成分研究).ChinaJournalofChineseMateriaMedica(中国中药杂志)，2008,33(24):2911.

[8]TAOChun-mei(陶春梅)，YUZhi-guo(于治国)，YUANLu(袁璐)etal.HPLCdeterminationofsaffloryellowAincarthamustinctoriusL(红花药材中红花黄色素A的HPLC测定).NorthwestpharmaceuticalJournal(西北药学杂志)，2006,21(6):254-255.

[9]YAOMiao-miao(姚苗苗)，RENAi-nong(任爱农)，DONGZhong-cai(董仲才).RP-HPLCdetermination