三明市健康人群乙型肝炎病毒患者和丙型肝炎病

三明市健康人群乙型肝炎病毒患者和丙型肝炎病

黄思晓

黄思晓(福建省三明市第一医院检验科福建三明365000)

【摘要】目的了解三明市健康人群、乙型肝炎病毒（HBV）患者和丙型肝炎病毒（HCV）携带者输血传播病毒（TTV）的感染情况,探讨三明市人群所感染TTV的基因群别分布情况。方法准备106名健康人群、64名HBV患者和36名HCV携带者的血浆。设计24对序列特异性引物，G1-G5群特异性巢式PCR，分别检测三组血浆中TTV的5种基因群的DNA。结果（1）使用群特异性PCR检测TTV，G4群TTV感染率最高，为52.0%，然后依次为G5:39.1%，G3:32.7%，G1:25.7%，G2:8.4%。（2）TTV常常混合感染：检测出2种属于不同群TTV感染的实验标本为数不少（19.8%），有4份标本甚至检测出属于3种不同群TTV－DNA。HBV患者组，检测出2种属于不同群TTV的比率占56.3%，有5个实验对象和2个实验对象分别检测出3重(群)和4重(群)TTV感染。结论：1-5群的TTV都可以在三个组别中被检测出，HBV组和HCV组各群TTV的感染率比健康人群组高。TTV易发生混合群感染，

【关键词】TTVHBVHCV巢式PCR基因序列

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）35-0047-01

目前TTV的检测方法主要依靠巢式PCR，因为TTV在血浆中滴度是很低的，巢式PCR可以提高其检测的特异性和灵敏度。但由于TTV的变异程度比较高，因此PCR检测时对引物选择是非常重要的。日本学者最早根据CloneN22基因序列设计引物，进行巢式PCR扩增，检测TTV-DNA，结果发现该套引物检出率低。后来其他研究者发现在TTV非转录区（UTR）存在一些高度保守序列[1]，根据这部分序列所设计的引物检测TTV-DNA，敏感性明显提高。但由于TTV不同群之间的变异程度相当大，因此设计不同的引物对TTV不同基因群别进行分群检测也是非常必要的。

1材料与方法

1.1标本来源：随机选取在三明第一医院体检科抽血健康人106名和随机选取三明市第一医院住院的HBV患者64名和门诊就诊的HCV携带者32名。

1.2DNA的抽提采用高纯度病毒核酸提取试剂盒参照说明进行。

1.3引物的设计参照GenBank中发表的各群TTV全部基因序列，进行核苷酸序列比对，合理设计出1－5群TTV引物。各套PCR体系引物的位置序列、极性和产物大小见表(1)

1.4PCR反应条件和PCR反应产物的检测1-5群TTV的检测采用巢式PCR（其中G4采用半巢式PCR）。各反应体系和反应条件有所不同，将1-5群巢式PCR的反应体系PCR扩增体系和循环参数以及PCR反应产物的检测按文献[2]。

2结果

各组TTV1-5各群感染率，在TTV各群总感染率中，G4群TTV感染率最高，为52.0%（105/202），然后依次为G5:39.1%(79/202)，G3:32.7%66/202(66/202)，G1:25.7%(52/202)，G2:8.4%(17/202)。三个组群TTV感染率高低和总感染率的高低排序是相同的。从三个组1-5群TTV平均感染率的比较上看，HBV患者和HCV携带者TTV各群平均感染率（45.0%和37.8%）比健康人群（23.8%）高(x2=27.32，p<0.01，x2=18.52，p<0.01)。HBV组TTV各群平均感染率和HCV组各群平均感染率相比较没有显著区别（x2=2.29，p>0.05）。

如实验所示，TTV常常混合感染。测出2种属于不同群TTV感染实验者也有不少（19.8%），4份标本甚至检测出了属于3种不同群TTV－DNA。HBV患者组中，检测出1种TTV-DNA和2种属于不同群TTV-DNA，分别占29.7%和56.3%，5份标本和2份标本检测出3重(群)和4重(群)TTV的感染。HCV携带者组中，检测出1种TTV-DNA和2种属于不同群TTV-DNA，分别占28.1%和31.2%，9份标本和4份标本可以检测出3重(群)和4重(群)TTV的感染。

3讨论

不同TTV分离株的基因序列变异性很强，相互之间差异性可高达到40%。根据相互之间基因序列差异度，TTV被分为五个基因群。本研究设计五种基因群的不同引物，用巢式（半巢式）PCR方法扩增TTV-DNA。第一轮PCR产物片段比较大，然后在第一轮产物基础上，进行第二轮扩增，其产物的片段相对第一轮较小。进行两轮PCR的原因是因为TTV在人体内的病毒量比较少，两次PCR可以提高核酸扩增的灵敏度，同时可以增加扩增的TTV-DNA特异性，便于更好区分不同群的TTV。

随着其他研究者对一些潜在新TTV基因的认识，我们会发现，作为一种DNA病毒来说，TTV基因序列的变异程度确实是相当大的。TA278是最早被发现的TTV基因分离株，由日本人于1997年鉴定的。而归属于第2群的病毒分离株PMV和KAV，是在欧洲鉴定认识的，归属于1群的JA1和归属于第3群的TUS01是在美国被鉴定认识的。其中，在亚洲进行鉴定和研究TTV分离株是最多的，而在其他大洲，有关于TTV基因群和基因型别分布的数据相对较少。本研究的结果说明了1-5群TTV在三明市流行分布，在总共202份的标本中，第4群TTV的感染率最高，之后是5，3，1，2群。在健康人群组，HBV组，HCV组中，所有基因群都有被检测到。研究中发现，第2群TTV的感染率较低，这在以前其他人的研究中也有所证实。

大量研究表明在同一个体中，可以同时检测出几种属于不同群别的TTV分离株。2002年Peng等在17份日本和6份中国婴儿的标本中检测到了6种TTV基因克隆，发现1份日本和3份中国婴儿标本感染有两种属于不同基因群TTV，另外有1份标本感染有3种属于不同基因群TTV。本研究实验也表明相同结果，献血组有21份标本检测出2种属于不同基因群TTV，有4份标本检测出了3种属于不同群TTV。HBV组中，36份标本检测出2种属于不同群的TTV，有5份标本和2份标本可以检测出3重（群）和4重（群）TTV的感染。HCV组中，10份标本检测出2种属于不同群的TTV，有9份标本和4份标本可以检测出3重（群）和4重（群）的TTV的感染。

TTV与其他传染性病毒常常共感染。在共感染有其他病毒(如本研究中的HBV、HCV)实验对象的分群TTV检测中发现，双重甚至多重混合感染属于不同群TTV比正常人群（如健康人群）来的更频繁，比例更高。有研究者认为这很可能是由于HBV患者和HCV携带者免疫力下降，使其更容易感染上TTV。

TTV已经发现了有十多年，国内外的研究者做了大量工作，取得了很多的进展，但是关于TTV的许多问题仍然未能解决，例如动物模型的建立，TTV是否致病以及对致病机理的探索，简单且又准确的诊断指标等等，因此对于TTV的研究仍然有多值得探讨的问题。

参考文献

[1]彭宜红,彭进.一种新的TTV基因群全基因序列测定及基因结构分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(4):307-310.

[2]吉建民.不同镁离子浓度对TTV核酸检测的影响[J].实用医技杂志,2004,11(8):331-332

[3]彭进,王清,胡烈谱.第.1、4、5基因群感染检测分析[J].中国公共卫生,2005,21(5):564-566.