脑灵汤对阿尔茨海默病大鼠海马BDNF及其受体TrkβmRNA表达的影响

脑灵汤对阿尔茨海默病大鼠海马BDNF及其受体TrkβmRNA表达的影响

肖智

长沙市第三医院湖南长沙410100

摘要：目的：观察脑灵汤对阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease，AD）模型大鼠海马BDNF（脑源性神经营养因子）及其受体TrkβmRNA表达的影响，初步探讨脑灵汤对阿尔茨海默病模型大鼠的治疗作用及其可能的作用机制，为指导临床应用和开发新药提供理论和实验依据。方法：将30只纯系SD大鼠完全随机分为正常组、假手术组、模型组、脑灵汤组（中药组）和盐酸多奈哌齐组（西药组）。用Aβ1-42注射大鼠海马制作AD大鼠模型，造模后灌胃四周取脑组织作切片，采用原位杂交方法研究BDNF及其受体TrkβmRNA在大鼠海马的表达。结果：⑴BDNFmRNA原位杂交结果显示，各组大鼠海马BDNFmRNA平均灰度值比较，模型组高于正常组与假手术组，而中药组与西药组低于模型组（P<0.05），具有统计学意义。（2）TrkβmRNA原位杂交组化结果显示，各组大鼠海马TrkβmRNA平均灰度值比较，模型组高于正常组与假手术组，而中药组与西药组低于模型组（P<0.05），具有统计学意义。结论：脑灵汤可适当增加AD大鼠海马BDNF及其受体TrkβmRNA的表达，这可能是脑灵汤治疗阿尔茨海默病的部分作用机制。

关键词：脑灵汤；阿尔茨海默病；Aβ；Trkβ；mRNA；BDNF

阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）是一种多病因介导的疾病，是以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性病变。临床以大脑皮质获得性高级功能受损，即痴呆为主要特征，包括不同程度的记忆力、感觉能力、判断力、思维能力、运动能力等受损，以及情感反应障碍和性格改变。AD的一个主要病理特征是海马萎缩，而脑源性神经营养因子（brain．derivedneurotrophicfactor，BDNF）与海马萎缩关系密切，参与神经可塑性的调节[1]。BDNF[2-6]是神经元和神经胶质细胞重要的神经营养因子，其氨基酸结构序列在脊椎动物的进化过程中高度保守，且有神经营养因子相关性配基存在，被认为是记忆形成过程中的关键蛋白之一，主要由海马和大脑皮质的神经元产生，海马神经元的BDNF含量变化与认知保护有着密切的关系：BDNF能快速增强海马神经元突触传递和神经递质的释放[5]，而患者海马BDNFmRNA表达明显减少，提示BDNF与AD发病关系密切。Trkβ是由酪氨酸激酶原癌基因编码的一种NTFs高亲和受体，BDNF发挥生物学效应有赖于与其特异性受体Trkβ的结合。Dragunow[7]等的研究证明BDNF及Trkβ受体可诱导海马锥体细胞产生持久的长时程增强（LTP），提示他们在学习记忆中起着重要作用。本实验采用向大鼠海马内注射Aβ1-42方法建立AD模型，用脑灵汤对AD动物模型进行干预，观察脑灵汤对模型海马BDNF及其受体TrkβmRNA的表达等方面的影响，揭示AD发病的部分机理和脑灵汤防治AD的部分作用机制。

1．材料与方法

1.1实验动物的选择及分组

选用健康6月龄SD（Spragu-Dawley）大鼠30只（300±50，雄性）清洁级，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供，合格证号：SYXK（湘）2004-0013动物在标准环境[温度（20-25）℃，湿度（45±10）%]自由饮水和进食，保持充足的光照和通风。再随机（按随机数字表法）分为正常组、假手术组、模型组、脑灵汤组（中药组）、盐酸多奈哌齐（西药组）5组，每组6只。

1.2实验药物

脑灵汤：由何首乌、红景天、白参、淫阳藿、杜仲、蛇床子、石菖蒲、补骨脂八味药按特定的比例组成。将以上八味药，每剂含生药104g，浸泡30min，加水文火煎煮两次，第一次60分钟，第二次40分钟，合并煎液，过80目筛滤过，95℃水浴浓缩（2.9g/ml），药物制成后，高压灭菌消毒分装，4℃冰箱保存备用。

盐酸多耐派齐片（思博海）：重庆桑田药业有限公司，批号：20080801。用前用双蒸水经超声细胞粉碎机制成浓度为0.12mg/ml的混悬液，药物配制后置4℃冰箱保存备用，用前摇匀。

1.3动物的给药

于海马注射Aβ1～42前一周始，正常组、假手术组和模型组的大鼠用1mL/d的蒸馏水灌胃；中药组大鼠用所配脑灵汤药液分别按1mL/d（9.6g/kg.d）灌胃；西药组大鼠用多奈哌齐药液按1ml/d（0.4mg/kg.d）灌胃，每日灌胃1次，共4周。

以上动物的给药剂量根据“常用实验动物与人的体表面积比值（R）表”而得出。

1.4动物模型的建立

在灌胃一周后，应用凝聚态β－淀粉样多肽片断（Aβ1-42）在大鼠双侧海马区进行微量注射，建立AD样病理模型[8]。假手术组在海马内注射等量的生理盐水。正常组不予手术。

1.5脑片的制作处理及试验方法

各组每只大鼠BDNF和Trkβ各6张脑片，进行BDNF、TrkβmRNA原位杂交试验

1.6统计学分析

此次研究的所有资料和数据采用SPSS13.0软件处理，数据以均数±标准差（）表示，组间差异的显著性用方差分析法检验，组间两两比较用LSD-t检验，P﹤0.05为显著性差异.图表绘制由EXCEL2003统计软件完成。

2．结果

2.1BDNFmRNA原位杂交实验结果

在光镜下，BDNFmRNA原位杂交阳性细胞呈棕黄色颗粒。正常大鼠在海马CA3区的锥体细胞内均可见BDNFmRNA原位杂交阳性信号表达。模型组大鼠海马CA3区的锥体细胞内的BDNFmRNA原位杂交信号强度明显减少。在中药组和西药组的大鼠海马内在CA3区的锥体细胞内BDNFmRNA原位杂交信号强度表达较模型组明显增加。各组大鼠海马神经元内BDNFmRNA原位杂交信号强度的平均灰度值比较（见表1-1），表中所示：各组杂交信号强度表达量经方差分析显示，总的组间差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较发现，与正常组比较，模型组CA3区BDNFmRNA杂交信号强度减少，其灰度值增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，西药组和中药组CA3区BDNFmRNA杂交信号强度明显增加，其灰度值明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.讨论

阿尔茨海默病（Alzheimer’Sdisease，AD）是一种以痴呆为主要症状的进行性神经退行性疾病，主要发生于老年及老年前期，原因尚不明确。其典型的病理特征是老年斑和神经原纤维缠结及神经元变性、坏死[9].大量的实验研究表明海马是AD最早和最易受损的部位，因此本实验研究以大鼠海马为观察点。

中医学认为老年痴呆症属于“文痴”、“呆病”、“健忘”、“虚劳”、“善忘”等范畴，其病位在脑，与心肝脾肾功能失调关系密切[10]。根据AD中医病因病机特点及治疗AD的临床经验并参考现代药理学的研究，选用由何首乌、白参、红景天、淫羊藿、杜仲、蛇床子、石菖蒲、补骨脂组成的脑灵汤进行治疗，首乌补肝肾、益精血，为君药；白参益气行血、红景天活血祛瘀，为臣药；杜仲、补骨脂、淫羊藿、蛇床子滋补肝肾，为佐药；菖蒲化痰安神定志，为使药，与红景天配伍，一豁一化，使痰去淤散，神智复聪，二者相得益彰。诸药合用，补虚驱邪，标本同治，补虚不留邪，驱邪不伤正，其功能是在补肾活血的基础上，辅以益气化痰开窍。

本次试验研究对6组AD大鼠脑片进行原位杂交试验，各组大鼠海马区BDNF及其受体TrkβmRNA原位杂交信号的灰度值，模型组最高，脑灵汤组低于模型组，说明脑灵汤能增加AD大鼠海马下调的BDNF及其受体TrkβmRNA的表达，可能通过这种机制改善突触功能，增强记忆。

参考文献：

[1]曾梅，鲁亚平，许浩，等.雌激素受体α和Bcl22在阿尔茨海默病患者海马中的共存[J].中国医学科学院学报，2004，26（2）：108-111.

[2].CreeleyC，WozniakDF，LabruyereJ，eta1．Lowdosesofmemantinedisruptmemoryinadultrats[J1．JNeurosci，2006；26（15）：3923

[3].Fassbenderl（’SimonsM，BergnmunC，eta1．Simvas．tatinstronglyreduceslevelsofAlzheimegsdiseasebetaamyloidpeptidesAbeta42andAbeta40invitroandinvivo[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2001，98（10）：5856-61．

[4].RaskindMA，PeskindER，TruyenL，eta1.Thecognitivebenefitsofgalantaminearesustainedforatleast36months：alongtermextensiontria1．ArchNeurol，2004，61（2）：252—256．

[5].傅仁杰．老年呆病的诊断、辨证分型及疗效评定标准.中医杂志，1991，32（2）：56．

[6]HallJ，ThomasKL，EverittBJ.RapidandselectiveinductionofBDNFexpressioninthehippocampusduringcontextuallearning[J].NatNeurosci，2000，3（6）：533-535.

[7]DragunowM，HughesP，Mason2ParkarSE，etal.TrkBexpressionindentategranulecellsisassociatedwithalatephaseoflongtarmpotentlatlon[J].BrainRes，1997，64（1）：274-275

[8]薛斌，荣成，张晓等。阿尔茨海默病动物模型建立方法的论述.[J]科技信息，博士.专家论坛：61-81.

[9]盛树力.老年性痴呆：从分子生物学到临床诊治.北京：科技文献出版社，1998.1．

[10]周仲瑛，主编.常见病中医临床手册[M].第3版，北京：人民卫生出版社，2006：242-245.