发育期大鼠反复惊厥中GRP78/caspase12的表达及7-NI对其影响的研究

发育期大鼠反复惊厥中GRP78/caspase12的表达及7-NI对其影响的研究

王显鹤杨占双张洋聂影

佳木斯大学附属第一医院黑龙江佳木斯154003

摘要：目的：探讨分析发育期?大?鼠在反复惊厥中的状态下GRP78（葡萄糖调节蛋?白78）、Caspase-12（半胱天冬蛋?白酶12）和7-NI（7-硝基吲唑）的表达变化及7-NI对其影响。方法：选取144只Wistar?大?鼠，按照随机分配的原则分成3组：对照组、惊厥组、7-硝基吲唑治疗组，每组48只。分别最后一次惊厥处理理后的6h、12h、24h、72h的5个不不同的时间点取海?马组织，利利用免疫组化法和半定量量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测3组组织内GRP78和Caspase-12表达?水平，并进?行行统计学分析。结果：免疫组化结果显示，与对照组相?比惊厥组有明显的液化灶，脑组织?水肿程度明显。对照组中GRP78和caspase-12阳性细胞数最少，其中7-NI治疗组GRP78阳性细胞数?高于惊厥组对照，相反caspase-12阳性细胞数数惊厥组的表达量量?高于7-NI治疗组，差异具有统计学意义（P<0.05）。并且GRP78阳性细胞数在12h达到最高值，caspase-12阳性细胞数在24h达到最?高值，RT-PCR结果与免疫组化结果?一致。结论：发育期?大?鼠在反复惊厥发作时GRP78（葡萄糖调节蛋?白78）和Caspase-12表达均升?高，GRP78表达最?高值早于caspase-12。7-NI治疗能够反复惊厥可能机制是通过抑制抑制GRP78及Caspase-12为标志的内质?网应激途径，抑制惊厥的发作，对神经系统起到初步的保护作用。

关键词：发育期；反复惊厥；GRP78/caspase12；7-NI；

惊厥是?一种神经系统的急性危重病症，多发于幼?儿，年年龄越?小发表率越?高，短时间的抽搐对神经系统没有较?大的影响，但是?长时间抽搐严重损伤?大脑神经系统，可导致神经元的凋亡和坏死[1-3]。反复惊厥发作促使了了癫痫的发?生，并且在这?一过程中体内产?生了了?大量量的活性氧和过氧化物。

1材料与方法

1.1主要实验材料料

21?日龄的健康清洁级Wistar?大?鼠144只购买于?长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，吉林林省动物质量量检测合格，体重?无组间差异。氯化锂和匹罗卡品购买于Sigma公司，7-NI购买于梯希爱化成?工业发展有限公司，GRP78兔抗?大?鼠抗体、Caspase-12兔抗?大?鼠抗体、Trizol、逆转录RT试剂盒和PCR试剂盒均购买于天津索罗?门?生物科技有限公司。

1.2实验?方法

对照组（n=48）：?无Licl-Pilo和7-NI处理理。

SR组（n=48）：给予Licl-Pilo（?首剂量量为100mg/kg·次·d）诱导惊厥，每隔?一天?一次，总共5次，?无7-NI处理理。

7-NI治疗组（n=48），7-NI（100mg/kg·次·d）30min后，Pilo腹腔注射。

1.2.1动物标本的制备

最后?一次惊厥处理理后，在不不同的时间灌流固定法处死?大?鼠，取?一部分脑组织，4%多聚

甲醛中固定24h，常规脱?水、浸蜡、?石蜡包埋和切?片，然后进?行行免疫组化，另?一部分放置于

-80℃保存备?用，?用于RT-PCR实验。

1.2.2RT-PCR法检测GRP78和caspase-12mRNA的表达

按照逆转录试剂盒说明书逆转率cDNA，以cDNA为模板进?行行RT-PCR，按照表2的反应体积加样，按照表3的反应条件进?行行反应，凝胶电泳，观察PCR结果。

1.3统计学分析

?用SPSS22统计软件处理理，数据以x±s表示，样本间的?比较采?用单因素?方差分析

（One—WayANOVA），均数的两两?比较采?用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RT-PCR检测结果

对照组GRP78和Caspase-12mRNA表达较低，GRP78mRNA在惊厥12h时电泳条带最亮，?而Caspase-12在惊厥24h时电泳条带最亮，与免疫组化结果相吻合。（?见表6）

表6Caspase-12（OD值）/GAPDH（OD值）?比较（n=6）

3讨论

多种因素可诱发新?生?儿惊厥的发?生，如若不不能及时治疗神经系统后遗症的发?生率很?高，常?见的惊厥神经系统后遗症有脑瘫、智?力力低下和癫?疒间等[10，11]。随着振幅整合脑电图、影像学检查、串串联质谱技术对遗传代谢性疾病的筛查和外科?手术的进?一步发展，新?生?儿惊厥的发现、诊断、及其治疗效率得打了了?大幅度的提?高，减少惊厥引起的神经系统后遗症的发?生[12]。

惊厥发作导致的脑缺?血及氧化应激等作为应激源可引发内质?网应激。GRPS是UPR的标志物，Caspase-12内质?网应激的关键性分?子，两者都是内质?网凋亡过程中的关键分?子[6，7]。本研究通过免疫组化和RT-PCR实验共同证实了了在反复惊厥发作时时GRP78及Caspase-12均上调，但GRP78早于Caspase-12。GRP78在惊厥早期通过UPR防御机制起到保护作?用，随着实验进展，防御机制发?生障碍，GRP78表达下降，启动下游凋亡因?子Caspase-12，Caspase-12表达增加，促进凋亡。GRP78在惊厥早期通过UPR防御机制起到保护作?用，随着实验进展，防御机制发?生障碍，GRP78表达下降，启动下游凋亡因?子Caspase-12，Caspase-12表达增加，促进凋亡。因此，GRP78对细胞凋亡平衡的维持?至关重要。

氧自由基是内质网发生应激的应激源，反复惊厥是的体内自由基生成增加，诱发内质?网应激反应凋亡途径。Tominaga等证实脑缺血模型中7-NI可以为选择性nNOS抑制剂，可以抑制NO及ONOO-对神经元的损害，起到保护神经系统的作用[8]。Huang指出，脑缺血后激活nNOS加剧了了DNA的氧化损伤，促进神经元凋亡的发生。并且研究证实NOD抑制剂可以下调caspase的表达，阻碍内质网应激途径的发生，GRP78表达增加，维持了了内质?网的稳态，保护了了神经元[9]。以上结果共同证实了了反复惊厥导致脑损伤早期GRP78通过UPR防御抵御脑损伤，抑制凋亡的发?生；7-NI作为nNOS的抑制剂，抑制氧?自由基的过多产?生，起到保护神经元的作?用。多项动物模型及临床研究证实了了?自由基损伤与多项神经系统疾病相关，抗氧化剂在神经系统疾病中的临床应?用具有重要的实际意义[3]。因此，7-NI作为氧?自由基的抑制剂有望应?用于临床治疗神经系统类疾病如惊厥等。本实验对7-Nl在?大?鼠发育期反复惊厥中可能的保护作?用机制进?行行了了初步探讨，从?而为临床防治新?生?儿惊厥引起的神经系统疾病提供了了实验依据。

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[12]贺芬萍，彭?小明，吴运芹，等.新生儿惊厥的诊断治疗研究新进展[J].当代护士（下旬刊），2015（05）：5-7.

项目编号：佳木斯大学校级自然科学基础研究面上项目、项目号S2014-006