大血藤水提物对大鼠卵巢雌孕激素受体的影响

大血藤水提物对大鼠卵巢雌孕激素受体的影响

夏瑶宾1赫银再2刘彦恒2（通讯作者）

夏瑶宾1赫银再2刘彦恒2（通讯作者）

【摘要】目的观察大血藤对大鼠血清中雌二醇（E2）和孕酮（P）含量以及大鼠卵巢组织中雌激素受体（ERα、ERβ）、孕激素受体（PR）的表达水平的影响。方法将雌性wistar大鼠50只随机平均分为5组：正常组、大血藤高、中、低剂量组（47,235，470mg.Kg-1）、三苯氧胺组。灌胃给药，连续21d。结果与三苯氧胺组和正常对照组相比大血藤各剂量组大鼠卵巢细胞中ERα表达水平明显升高,ERβ表达水平明显下降（P＜0.05）；卵巢重量与正常组相似，明显高于三苯氧胺组（P＜0.01）。与三苯氧胺组比较，大血藤各组PR的阳性细胞表达值升高，有统计学意义（P＜0.01）。结论大血藤水提物明显上调ERα表达，下调ERβ表达，不影响卵巢重量。

【关键词】大血藤；植物雌激素样效应；卵巢；雌激素受体、孕激素受体

大血藤为木通科植物大血藤Sargentodoxecuneata(Oliv)Rehd.etWils的干燥藤茎[1]。功能主治痛经、闭经[2],临床用于治疗经闭、痛经、月经不调、崩漏[3]、子宫内膜异位症、炎性继发性不孕症等[4]，并具有抗肿瘤［4］、免疫抑制[3]等多种药理活性。多年来大血藤及其复方用于妇科临床，提示大血藤可能通过调控雌激素信号通路，影响雌孕激素水平和受体表达等途径，而实现治疗作用的。本研究采用成年雌性大鼠为研究对象，通过观察外周雌孕激素水平，卵巢系数、及其雌孕激素受体光密度值，初步探讨大血藤用于妇科临床的药理学依据。为临床应用提供依据。

材料与方法

1．药品及试剂大血藤药材由安徽源和堂药业股份有限公司提供，经内蒙古食品药品检验所鉴定均为纯正药材。批号：20130226。样品制备：用3倍量95%乙醇回流提取2次,每次1.5h,提取后的药渣再用3倍量的水煎煮2次,每次1.5h,合并2次乙醇提取液和水煎液,分别减压浓缩真空干燥即得醇提物和水提物（以水提物为试验药品）。枸橼酸他莫西芬片（三苯氧胺），扬子江药业集团有限公司，10mg/片，60片/盒，产品批号：13110211。以上各药以60kg人为标准，按照体重换算法计算给药剂量。孕酮（p）：批号：20140522；雌二醇(E2)批号：20140513；一抗：雌激素受体α（ERα），英国Abcam公司，货号：ab32063；雌激素受体β（ERβ），英国Abcam公司，货号：ab3576；PR抗体，英国Abcam公司，货号：ab131486；二抗：上海长岛生物技术有限公司产品。多聚赖氨酸，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9006。

2．仪器IMS图象分析系统:摄像机PANASONIC,型号:MV-CP410;显微镜,型号:OLYMPUSBH2,数码相机,型号:NIKON,基尔顿生物科技（上海）有限公司；Haiher超低温冰箱，中国制造；LeicaRM2235石蜡切片机，北京众力挽生物科技有限公司；LeicaHI1220水平干式烘干仪，北京众力挽生物科技有限公司；JY3002电子天平，上海精密科学仪器有限公司；隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；800型离心沉淀器，上海手术器械厂；酶标仪，芬兰（LabsystemsMultiskanMS）公司；洗板机，芬兰（ThermoLabsystems）公司。移液器，吉尔森P型移液器(Pipetman)。其他所需耗材均为国产。

3．动物成年wistar大鼠，雌性，体重190.4±12.1g，50只，8～9周龄，内蒙古大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（蒙）2014-0020。

4．分组适应性饲养一周后，按完全随机分组，设正常组、三苯氧胺组(0.33mg.kg-1)、己烯雌酚组(8.3×103mg.kg-1)、大血藤低剂量组、大血藤高剂量组(47,470mg.kg-1，分别相当大血藤生药量的2.5,25g.kg-1,为成人剂量的10，100倍)，每组10只。

5．给药前5d起查阴道脱落细胞涂片，每日一次，判断大鼠性周期。于分泌期开始给药，给药结束前5d起查阴道脱落细胞涂片至给药结束。给药期间每5d称一次体重。给药剂量以60kg人每日量为标准。每天灌胃给药，连续21d。

6．血清E2、P水平的检测于末次给药后第一天。腹腔内注射20%乌拉坦麻醉大鼠，腹主动脉采血，静置20min后，2000r.min,分离血清，置于冰箱中备用,按照试剂盒说明书检测大鼠E2、P含量。以标准物的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，计算出标准曲线的多项式二次回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

7．卵巢质量末次给药后第一天，20%乌拉坦麻醉大鼠，取出卵巢，电子天平称子宫质量;计算卵巢系数。

8．卵巢质量与PR、ERα以及ERβ检测于末次给药后第一天。腹腔内注射20%乌拉坦麻醉大鼠，下腹部备皮，于耻骨联合上约5mm处纵向剪开腹部皮肤及肌肉层，充分暴露腹内脏器，找到双侧子宫，分别取出，电子天平称卵巢质量;计算卵巢系数，放入4%多聚甲醛溶液中固定。固定：1、Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构；2、脱水透明；3、浸蜡包埋；4、切片与贴片；5、脱蜡染色HE染色；6、脱水透明；7、封固等严格按说明书操作。图像采集步骤：①先点击图像中微尺上的两个点，再将它的实际微米数输入计算机，计算机自动计算得到比例因子后存储备用。②消除背景：本命令能把免疫组化中的紫色背景从图像上去除。③选阴性区域：操作时用鼠标器选择阴性区域，处理后有效阴性区域用蓝色表示。此功能可和选阳性区域功能交替使用。④选阳性区域：操作时用鼠标器选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后有效阳性区域用红色表示。此功能可和选阴性区域功能交替使用。⑤测量：测量方式可选全视场测量。否则，需选择测量区域（用鼠标选择任意区域或选择矩形区域）。⑥测量结果：免疫组化图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值（OpticalDensity）。⑦单位换算：总面积=351000像素点；阳性面积1个像素点=0.095um2。阳性数值的高低代表阳性表达的强弱。

9．统计学处理实验所得数据用SPSS17.0统计软件分析，结果均用(±s)表示，采用ANOVA(one-wayanalysisofvariance)单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P＜0.05为有统计学意义。

结果

1．卵巢组织中，大血藤高剂量组上调ERα在卵巢的阳性细胞表达，明显高于正常组（P＜0.001）、三苯氧胺组（P＜0.009）。大血藤各组ERβ阳性细胞表达值明显低于正常组（p＜0.000）和三苯氧胺组（p＜0.027）；PR阳性细胞表达：大血藤各剂量组明显高于三苯氧胺组（P＜0.001,0.02），与正常组相似。见表1

讨论

女性/雌性正常的月经周期/动情周期是子宫内膜在女性性腺卵巢所分泌的雌激素(E)和孕激素(P)等性激素作用下周期性变化的结果[4]。卵巢内分泌功能受多种因素的调节，其中包括E,P的自分泌或旁分泌调节作用[5]即E,P由卵巢细胞分泌后，又会反馈作用于卵巢细胞，调节其内分泌功能。而E,P对卵巢功能的调节是通过与分布在卵巢细胞内的特异性受体即雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)结合而实现的。在应用基因敲出技术进行的动物实验模型中，ER基因敲出小鼠卵泡成熟功能障碍，卵巢功能严重受损[6,7].PR基因敲出小鼠不但不能排卵，甚至不能对外源性激素产生反应[8,9]可见ER和PR是维持卵巢功能的重要的分子结构基础。

卵巢主要表达ERβ,ERα的表达不占优势。卵巢ERα虽然不多,但在激活基因方面比ERβ更有效[10]。有研究表明[11]:卵巢雌激素可通过旁分泌及自分泌途径作用于卵巢颗粒细胞中的ERα,在卵泡发育和雌激素生成微环境中发挥主要的调节作用。而大血藤可能通过选择性ER调节作用,结合并上调卵巢ERα的蛋白表达,使巢局部微环境中雌激素的作用增强,从而缓解雌激素分泌减少引起的一系列临床征状态如经闭、月经不调、崩漏。此外，与正常组比较大血藤可升高外周血清雌激素水平，虽无统计学意义，但与改善雌激素减少引发的临床症状相关。ERα剔除的雌性鼠(ERαknockout,ERKO)不能受孕，子宫对雌二醇治疗无反应，卵巢含出血的卵泡[12]。推测大血藤治疗不孕症的作用可能与上调ERα表达及外周雌激素水平升高相关。

在人卵泡颗粒细胞中只表达ERβ而无ERα表达，表明ERβ是卵泡发育成熟过程中雌激素发挥功能的介导物。在分子水平上，ERβ通过经典的ERE途径、AP1和Spl位点，与内源性配体(如雌激素)或其他配体(如抗雌激素和植物雌激素)发生反应，进而活化一系列靶基因，调控靶组织(器官)某些正常生理功能(如维持骨密度，生殖器官的发育)的发挥和某些肿瘤的发生、发展过程。目前发现ERβ分5个亚型，ERβ1一5有不同的组织和细胞分布。在人体卵巢组织中主要分布ERβ2、4，ERβ2在肿瘤细胞中的表达上调[13]。因此,ERβ2在雌激素受体信号转导中可能扮演重要角色,并且具有重要的抵消ERα作用的功能。

子宫内膜异位症（Ems）中在位子宫内膜中主要表达ERα和ERβ，而在卵巢异位囊肿中主要表达ERβ，ERα表达受限。ERβ有可能在卵巢异位囊肿发生发展起主要作用。腺肌症（AM）中，异位病灶的ERα和ERβ的表达高于在位子宫内膜和正常子宫内膜，由此推测，在AM中，ERα和ERβ对子宫腺肌症的发生发展都起作用。在卵巢异位囊肿中，痛经因子环氧化酶-2(COX-2)、催产素受体(OTR)与ERβ有一定的相关性，而在AM中，COX-2、OTR有可能与ERα和ERβ都有关。推测雌激素是通过ERβ来上调卵巢异位囊肿的COX-2、OTR的表达，而在AM异位病灶中，雌激素是通过两种亚型共同调节的。OTR与痛经症状相关，推测COX-2、OTR系统与内异症及腺肌症相关症状如盆腔痛和／或痛经的发展有关系[14]。本研究显示，大血藤各组明显下调ERβ的表达，其治疗痛经、子宫内膜异位症、卵巢囊肿、相关肿瘤是否是因下调ERβ表达，而调控雌激素信号通路中一系列靶基因，靶组织(器官)的某些病理功能，进而控制疾病的发生、发展过程而实现治疗作用，有待进一步研究证实。

本研究选择三苯氧胺作对照是由于其和大血藤有相同的临床应用范围，两者差异在于，大血藤不影响PR表达水平和卵巢重量，并且上调ERα表达和下调ERβ表达的作用均强于三苯氧胺。近年国内、外大量研究表明,植物雌激素（PEs）具有抗增生、抗氧化、诱导细胞凋亡、调节免疫力等生物学作用。因此,PEs在性激素依赖性肿瘤如子宫内膜癌、乳腺癌的预防与治疗方面倍受重视。研究资料表明大血藤具有植物雌激素药效[2-3]，有关大血藤植物雌激素的临床和基础研究将成为今后研究的方向。

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