丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中钙通道Cav1.3表达的影响

丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中钙通道Cav1.3表达的影响

郭森1李海艳1孔祥玉1朱江2张杰3张玉坤

郭森1李海艳1孔祥玉1朱江2张杰3张玉坤3

【摘要】目的探讨丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马中钙通道Cav1.3表达的影响及其脑保护作用的机制。方法雄性Wistar大鼠36只,随机分为假手术组、缺血对照组和丁苯酞治疗组，每组12只。采用免疫组织化学方法和蛋白质印迹法分别检测各组大鼠海马中钙通道Cav1.3表达的情况。采用Nissl法观察大鼠海马内神经细胞缺血后的变化情况。结果与缺血对照组比较，丁苯酞治疗组大鼠海马中钙通道Cav1.3表达有所增加（P<0.05），但仍低于假手术组（P<0.05）。Nissl染色显示，丁苯酞治疗组大鼠海马中存活神经元明显多于缺血对照组。结论丁苯酞可以抑制缺血造成的大脑海马中钙通道Cav1.3表达的减少，减少缺血后海马中的神经元死亡。

【关键词】丁苯酞；脑缺血；海马；L型钙通道；大鼠

Effectsofn-butylphthalideonexpressionofcalciumchannelCav1.3inischemichippocampusinrats.GuoSen1,ZhuJiang2,LiHaiyang1,KongXiangyu1,ZhangJie3,ZhangYukun3.1.DepartmentofHumanAnatomy,2.Departmentofneurology,TheAffiliatedHospital,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China；3.ChengdeCountyHospitalChengde067400,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofn-butylphthalideonexpressionofcalciumchannelCav1.3inischemichippocampusinrats.Methods36MaleWistarratswerepidedrandomlyintothreegroups:ashamgroup,anischemiagroupandabutylphthalidetreatinggroup.Therewere12ratsineachgroup.ImmunohistochemicalstainingandWesternblottingwereusedtodetectexpressionofcalciumchannelCav1.3.Nisslstainingwasusedtoshowthechangeofneuronsinhippocampus.ResultsComparewiththeratsinshamgroup,theexpressionofcalciumchannelCav1.3decreasedobviouslyintheischemiagroupandbutylphthalidetreatinggroup.Comparewiththeratsintheischemiagroup,theexpressionofcalciumchannelCav1.3increasedobviouslyinthebutylphthalidetreatinggroup.Nisslstainingshowsthatinbutylphthalidetreatinggroupneuronsweremorethaninischemiagroup,butlessthaninshamgroup.ConclusionThen-butylphthalidecanrestrainthedeclineofexpressionofcalciumchannelCav1.3inischemiahippocampus,andprotectneurons.

【Keywords】n-butylphthalide;ischemia;hippocampus;L-typecalciumchannel;rat

L型钙通道是电压依赖型钙通道，可进一步分为Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4四个亚型。Cav1.3钙通道主要分布于中枢神经系统，参与钙稳态、激素分泌、基因表达和突触可塑性等多种功能的调控，并在神经元的存活和死亡中有重要作用[1]。有研究表明在急性脑缺血的早期，L型钙通道的开放是Ca2+内流的重要途径[2]。但在慢性脑缺血过程中L型钙通道的变化，报道较少。

丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)，是我国具有独立自主知识产权的国产I类化学新药，可以通过提高脑血流量、抗神经细胞凋亡、抑制氧化应激、减轻脑水肿等诸多途径对抗缺血后所造成的神经元损伤[3-6]。多年以来对其作用机制的研究一直广受关注，本项目应用免疫组织化学和蛋白印迹的方法，对丁苯酞在脑组织缺血过程中神经元钙通道Cav1.3表达方面的影响进行研究，以探讨丁苯酞在脑缺血过程中通过钙通道Cav1.3途径发挥保护作用的可能机制。

材料和方法

1．实验动物分组及用药

SPF级Wistar成年健康雄性大鼠，200～220g，36只大鼠随机分为3组，假手术组、缺血对照组和丁苯酞治疗组，每组12只，其中6只用于制作免疫组化标本，6只用于制作蛋白印迹标本。缺血对照组和丁苯酞治疗组大鼠阻断双侧颈总动脉，造成大鼠慢性脑缺血。假手术组只暴露双侧颈总动脉，不予阻断。丁苯酞治疗组大鼠术后，使用玻璃注射器进行腹腔注射丁苯酞注射液（5ml/kg）,每日2次。其余各组大鼠给予等量的生理盐水腹腔注射。各组大鼠均于术后21日给药后灌注取材。

2．主要药品及试剂

丁苯酞氯化钠注射液（中国石家庄制药集团有限公司），兔源性抗Cav1.3抗体（购自abcam公司），生物标记的山羊抗兔IgG抗体（购自北京中杉金桥公司），小鼠源性抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体、总蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、ECL化学发光底物（均购自武汉博士德公司）。

3．大鼠慢性脑缺血模型的制备

采用两血管阻断法[7]制作大鼠慢性脑缺血模型，Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）,仰位固定于手术操作台上，颈部正中切口，钝性分离胸锁乳突肌及气管旁血管和神经，暴露双侧颈总动脉并结扎切断，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素（1×105U/L）冲洗后缝合伤口。术后单笼保温饲养24小时。

4．标本的采集

4.1免疫组化标本的采集

大鼠腹腔内注射10％的水合氯醛麻醉（350mg/kg），开胸行主动脉插管，以200ml生理盐水经主动脉快速冲洗，随后灌入4％多聚甲醛400ml，固定，取出脑组织。组织后固定一夜，30%蔗糖中浸至组织下沉后行冠状切面冷冻切片（厚40μm）。

4.2Westernblot标本的采集

大鼠腹腔内注射10％的水合氯醛麻醉（350mg/kg），迅速断头取脑，PBS清洗血液，滤纸吸干表面液体，分提出大脑海马组织，称重，组织匀浆，提取蛋白，BCA法对蛋白进行定量。蛋白样品-80℃保存。

5．免疫组织化学染色

切片在0.01m/LPBS中漂洗10min×2，含0.3%H2O2的PBS中30min灭活内源性过氧化物酶，PBS中漂洗10min×3,含5%山羊血清2%BSA（BovineSerumAlbumin）的PBST（含0.1%TritonX-100的0.01m/LPBS）封闭2h，兔源性抗Cav1.3抗体（1:200）4℃孵育过夜，切片在PBST中漂洗15min×4，生物标记的山羊抗兔IgG抗体（1:400）室温孵育1h，PBST中漂洗10min×3，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（1:100）室温孵育1h，PBS中漂洗10min×3,在0.05%DAB显色液(0.05%DAB，0.03%H2O2，0.01mol/LPBS缓冲液)显色7min，贴片后，常规脱水、透明、封片。

6．Westernblot步骤

6%SDS-PAGE凝胶电泳（120V，2.5h），转膜（300mA，2h），蛋白上样量100μg，5%BSA中封闭2h，兔源性抗Cav1.3抗体（1:500）4℃孵育过夜，TBST漂洗10min×3，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（1:2000）室温孵育1h，TBST漂洗10min×3，ECL超敏发光液显影。

7．尼氏染色

切片用0.5%明胶贴片，自然干燥，常规尼氏染色（0.25%硫堇染液）。Nissl染色在本实验中要用于检测各组大鼠海马中神经元缺血后的改变及存活情况，因此各组大鼠的脑切片均在同一次染色中完成，以保证各组切片的染色条件完全相同。

8．图像分析

免疫组织化学染色和尼氏染色的图像采集时，严格保持照相条件的一致。免疫组织化学染色和尼氏染色照片分析时各组均取相同海马部位。

蛋白印迹的胶片扫描后，采用Image-ProPlus6.0软件对显影条带进行分析，以目的条带和β-actin条带的IOD比值作为目的蛋白的相对表达水平。

9．统计学处理

采用SPSS19.0软件进行统计，数据用±s表示。各组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验。

结果

1．钙通道Cav1.3免疫组织化学染色

切片中钙通道Cav1.3被染成棕黄色颗粒，位于细胞质内。假手术组大鼠大脑海马各区均有大量钙通道Cav1.3表达（图1C，F）；缺血对照组大鼠大脑海马各区中钙通道Cav1.3表达明显减少，CA1区阳性细胞层次较薄，CA3区阳性细胞染色浅分布稀疏（图1B，E）；丁苯酞治疗组大鼠大脑海马中钙通道Cav1.3表达与缺血对照组相比有明显增加，但仍少于假手术组，CA1区Cav1.3阳性细胞层次较缺血对照组厚，染色较深。CA3区阳性细胞分布较缺血对照组密集（图1A，D）。

2．海马神经元尼氏染色

缺血对照组海马CA1和CA3区中神经元分布稀疏，染色均较浅，提示在缺血对照组中海马神经元内尼氏体数量减少，神经元受损（图2B，E）。丁苯酞治疗组海马CA1和CA3区中神经元分布均较缺血对照组密集，大部分神经元染色较深（图2A，D）。假手术组海马CA1和CA3区中神经元分布密集，神经元内细胞核及核仁清晰，尼氏体染色较深。

3．蛋白印迹检测钙通道Cav1.3表达

大鼠大脑海马中钙通道Cav1.3表达情况见图3和图4，丁苯酞治疗组大鼠大脑海马中Cav1.3与β-actinIOD比值明显大于缺血对照组大鼠（P＜0.05），但仍小于假手术组大鼠（P＜0.05），提示丁苯酞对于缺血后大鼠海马中的钙通道Cav1.3有保护作用。

讨论

L-型钙通道是电压依赖性钙通道，有α1，α2，β，δ和γ5个亚单位组成。根据编码α1亚单位的基因，L-型钙通道又可分为Cav1.1，Cav1.2，Cav1.3，Cav1.4四种类型。其中Cav1.3在中枢神经系统有着广泛的分布，参与钙稳态、激素分泌、基因表达和突触可塑性等多种功能的调控并在神经元的生长发育中起到重要作用[8]，其在神经元损伤中的作用也一直广受关注[9-11]。早先的研究多集中在缺血早期L型钙通道的开放对细胞内Ca2+浓度的影响，并指出L型钙通道是Ca2+内流的主要通道。但随着对L型钙通道的研究的不断深入人们发现长期阻滞钙通道的开放可以诱导神经元的凋亡[12]，而慢性脑缺血过程中凋亡是神经元死亡的主要形式。因此有研究人员推测钙通道Cav1.3表达的减少也可能是造成神经元损伤的重要因素[13]。在研究中我们发现，慢性脑缺血大鼠海马中L型钙通道Cav1.3表达明显减少。钙通道Cav1.3表达的减少势必影响到其原本执行的功能，如维持神经元钙稳态，调控基因表达等重要生理功能将出现紊乱。在慢性持续性的缺血过程中，这些生理功能长期紊乱则可以成为造成神经元损伤促进其凋亡。

丁苯酞抗神经组织损伤的机制复杂，涉及多条信号通路，改善脑内微循环、抑制血小板聚集、保护线粒体、调节能量代谢、减轻氧化应激损伤、减少细胞凋亡等都是丁苯酞脑保护作用的重要机制[14-16]。在我们的研究中丁苯酞治疗组大鼠，海马中钙通道Cav1.3表达虽未能达到正常水平，但较缺血对照组已有明显增加，这说明丁苯酞可以抑制慢性缺血所致的对神经元钙通道Cav1.3表达减少。另一方面，从尼氏染色的结果可以看出，缺血对照组海马CA1和CA3区神经元减少，存活神经元也出现了不同程度的受损表现，而丁苯酞治疗组大鼠海马中CA1和CA3区神经元受损程度明显小于缺血对照组。丁苯酞注射液对慢性脑缺血大鼠海马中神经元起到了保护作用。因此我们推断，对于慢性脑缺血丁苯酞是可以通过保护L型钙通道Cav1.3，来保证神经元的钙稳态，基因表达等重要生理功能的正常执行，从而达到保护神经元的目的。但是丁苯酞是通过何种分子途径对钙通道Cav1.3进行保护的，仍有待进一步的研究和探讨。

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