单倍体造血干细胞移植联合供者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞治疗自体造血干细胞移植后复发的血液恶性肿瘤

单倍体造血干细胞移植联合供者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞治疗自体造血干细胞移植后复发的血液恶性肿瘤

颜新宇唐晓琼刘林

颜新宇唐晓琼刘林

【摘要】目的观察单倍体造血干细胞移植联合供者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞治疗自体干细胞移植后复发的血液恶性肿瘤的疗效。方法1例急性髓性白血病患者及1例T淋巴母细胞淋巴瘤/急性T淋巴细胞白血病患者经过常规化疗方案、自体移植后复发，对其实施单倍体造血干细胞移植。同时采集供者外周血单个核细胞在IFN-γ、IL-2、CD3单克隆抗体的刺激下进行体外培养，获得细胞因子诱导的杀伤细胞，反复多次回输给患者。结果两例患者造血重建过程顺利，移植过程中患者出现出血性膀胱炎。多次输注细胞因子诱导的杀伤细胞后，患者出现局限性慢性移植物抗宿主病，骨髓持续完全缓解。结论供者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞主要的效应细胞是CD3+CD56+细胞，CD8+细胞和干扰素-γ。它可以在单倍体造血干细胞移植后有效地清除微小残留病灶，延长无病生存期，而不加重移植物抗宿主病程度，值得进一步研究。

【关键词】供者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞；单倍体造血干细胞移植；移植物抗宿主病；急性髓性白血病；T淋巴母细胞淋巴瘤/急性T淋巴细胞白血病

Haploidenticalhematopoieticstemcelltransplantationcombinedwithdonor-derivedcytokine-inducedkillercellssuccessfullytreatedthepatientswithhematologicmalignanciesrelapsingafterautologousstemcelltransplantation

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofhaploidenticalhematopoieticstemcelltransplantationcombinedwithdonor-derivedcytokine-inducedkiller(CIK)cellstreatingthepatientswithhematologicmalignanciesrelapsingafterautologousstemcelltransplantation.MethodsOneacutemyeloidleukemiapatientandoneTlymphoblasticlymphoma/acuteTlymphoblasticleukemiapatientrelapsedposttheconventionalchemotherapiesandautologousstemcelltransplantation.Weappliedthehaploidenticalhematopoieticstemcelltransplantationimmediately.Consequently,usingcellseparatortoobtainthemobilizedperipheralbloodmononuclearcellsofdonors,thenCIKcellswereexpandedunderthestimulationwithIFN-γ,IL-2,OKT3.ResultsTheprocessoftwopatientsengraftedsuccessfully,theyhadhemorrhagiccystitisduringtheprocessoftransplantation.Afterrepeatlyinfusionsofcytokine-inducedkillercells,graft-versus-hostdiseaseofpatientsdidn’taggravate.Theirbonemarrowskeepcontinuouscompleteremission.ConclusionsThemajorcytotoxiceffectorscellsofcytokine-inducedkillercellsareCD3positive,CD56positive,andCD8positivecellswithinterferon-γ.Theycouldeliminatetheresidualdiseaseandprolongdiseasefreesurvivaltime,withoutexacerbatinggraft-versus-hostdisease.Furtherexperiencesinadditionalpatientswithlongerfollow-uparenecessary.

【Keywords】donor-derivedcytokine-inducedkillercells;haploidenticalhematopoieticstemcelltransplantation;graft-versus-hostdisease;acutemyeloidleukemia;Tlymphoblasticlymphoma/acuteTlymphoblasticleukemia

前言

复发/难治性血液恶性疾病在常规化疗后难以取得长时间的完全缓解。异基因造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)对多种血液疾病是一种可以治愈的方法。HSCT的治疗作用主要是通过移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemia,GVL)，但是这种作用是与移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,GVHD)密切相关的。抗白血病作用的有效程度与GVHD的严重程度相关联，在有着严重GVHD的病人身上可以观察到最低的疾病复发率[1]。在当代的中国，由于计划生育政策导致的家庭规模减小，而且骨髓干细胞库仍在发展当中，因此对于需要造血干细胞移植的病人，找到一个人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)完全匹配的供者相当困难，而且时间较长。当同胞间的HLA基因型不相合或不能找到HLA相合的无关供者，单倍体异基因造血干细胞移植可以对几乎所有的患者提供一个治疗的机会。相比较于HLA全相合移植，HLA半相合的异基因移植的GVL效应可以降低复发率[2,3]，但是，单倍体移植可能会导致更加严重的GVHD、移植失败及预处理引起的免疫缺陷[4]。近年来，随着单倍体造血干细胞移植技术的进步，移植成功率大为提高。从一个大规模的单倍体骨髓移植的恶性血液病患者中，超过99%的患者顺利地造血重建，在标危、高危、疾病进展期的病人中，2年无病生存率(diseasefreesurvival,DFS)分别为70.7%，49.6%，22.2%[5]。但单倍体移植和患者疾病状态有极大关系，如患者处于高危及复发状态，移植成功率及长期生存率低于10%，患者往往死于再次复发，因此寻找新的有效控制移植后复发的治疗方式显得尤为重要。在本次研究中，两例患者的复发病情进展迅速，寻找供者的时间不允许，于是进行单倍体造血干细胞移植，其后，为了降低复发风险，我们反复输注供者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞，以消除白血病残留病灶。

资料与方法

1．病例资料

1.1基本情况

年龄性别治疗前检查

患者114女血常规示Hb50g/L，WBC62.48×109/L,PLT23×109/L，可见幼稚细胞，骨髓穿刺：原始粒细胞65%，诊断为急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)。流式细胞结果：CD33，CD117，CD34，HLA-DR,MPO,CD7阳性，基因检测未检出BCR-ABL,PML-RARα,ETO-AML1，FLT3，MLL-AF4，E2A-PBX1，TEL-AML1；染色体del（9）（q22q34）。

患者223男颈部进行性肿大淋巴结，胸腹CT示多发淋巴结肿大，淋巴结活检及骨髓检查诊断T淋巴母细胞淋巴瘤/急性T淋巴细胞白血病(Tlymphoblasticlymphoma/acuteTlymphoblasticleukemia,TLBL/ATLBL)。淋巴结免疫组化：Ki-67(+++)70%,CD3(+),CD5(++),CD10(-),CD20(-),CD45R0(++),CD43(+++),CD79ɑ(-),TDT(+),BCL-2(+-),CYLIND1(-).

1.2初始治疗

化疗

患者12009年10月21日开始以DEA(daunorubicin60mgd1tod3,Ara-C160mgd1tod7,etoposide160mgd1tod3)行诱导治疗；1月后以相同方案行巩固化疗；2月后，MA(mitoxantrone10mgd1tod3,Ara-C2gd1tod5)方案继续巩固化疗；4月后，DA(daunorubicin60mgd1tod3,Ara-C2gd1tod5)方案行第四次巩固化疗。

患者22009年1月予以hyper-CVAD(CTX300mg/m2d1tod3,VCR2mgd4,11,ADM50mg/m2,d4-5,DXM10mgd1-4,11-14)方案及MTX(1g/m2,d1)、Ara-C(1.5g/m2,d2-3)各化疗1疗程，部分缓解，后又予hyper-CVAD巩固2疗程，完全缓解。

1.3自体造血干细胞移植

干细胞动员方案预处理方案重建情况

患者1CTX2g×2d,VP16100mg×2d,G-CSF5μg/kg/dAra-C2g×2d,BU3.2mg/kg×3d,CY2g×2dd+13WBC植入,d+19PLT植入

患者2CTX2g×2d,Ara-C2g×2d,G-CSF5μg/kg/dCTX50mg/kg×2d,VP16300mg/m2×3d,lomustine200mg/m2×1dd+10WBC植入,d+12PLT植入

1.4肿瘤复发

患者1于移植d+63到医院复查血常规示Hb83g/L，WBC26.27×109/L,PLT63×109/L，L42%，幼稚细胞51%，复查骨髓示原粒细胞61%，提示疾病复发。

患者2于移植后d+445，发现左锁骨上淋巴结明显增大，淋巴结活检示非霍奇金氏淋巴瘤，骨髓检查：淋巴瘤细胞78%，疾病复发。

2.单倍体造血干细胞移植治疗

患者无同胞间及全相合无关供者，故其父母为其半相合供者。两例患者及其监护人均签署知情同意书，报经医院伦理委员会同意后实施本项治疗。

2.1配型情况

详见table1和table2。

2.2供者动员及采集

采用G-CSF（特尔津，厦门特宝药业）5ug/kg/d，连续4、5日，用血细胞分离机（COBE，美国）采集供者外周血干细胞，其后在无菌手术室采集供者骨髓。

2.3单倍体移植预处理情况

两例患者预处理方案均包括：氟达拉滨(Fludarabine)25mg/m2；白消安(Busulphan)3.2mg/kg/d；环磷酰胺(Cyclophosphamide)50mg/kg/d；抗胸腺球蛋白(Anti-thymocyteglobulin,ATG)2.5mg/kg/d；患者2于D-2加用洛莫司汀(lomustine)320mg/d。具体用药见fig1。

图1单倍体造血干细胞移植的预处理方案

Fig1.conditioningregimeforthetwopatientsofthehaploidenticalHSCT

2.4支持治疗

感染预防：口服左氧氟沙星片预防细菌感染，氟康唑预防真菌感染，复方甲噁磺胺片预防卡氏肺囊虫感染，阿昔洛韦预防病毒感染；

GVHD预防：环孢素(Cyclosporine)2.5mg/kg/d,d-1开始静脉泵入至消化道症状消失改为口服，每周监测血药浓度，维持在150-250ng/ml；骁息(mycophenolatemofetil,MMF)0.5g，d-1开始每日二次至d+30；甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)d+1，+3，+6；CD25单抗(basiliximab)。

肝静脉闭塞综合症(Hepaticveno-occlusivedisease，VOD)的预防：前列地尔(Alprostadil)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholicacid)、低分子肝素(Lowmoleculeheparin)。

3.细胞因子诱导的杀伤细胞制备

3.1CIK细胞培养设备

SW-CJ-ZE型超净台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；COIC型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；TC2323-ZE型孵箱（美国SL公司）；HealForce212UVCO2培养箱；TDL-5M低速离心机；BD公司Cantor流式细胞仪。

3.2CIK细胞培养试剂

IFN-γ（上海凯茂生物医药有限公司）；重组人IL-2（北京双鹭药业有限公司）；CD3单克隆抗体（北京邦定生物公司）；GIBCO-RPMIMedium1640(InvitrogenCorporation)。

3.3CIK细胞培养过程

分别采集供者动员后外周血造血干细胞及自体血浆，以5-10×106cells/ml的浓度悬浮于含10%供者血清的1640培养基，放置在无菌培养瓶中，D0天，加入重组人IFN-γ,并处于37°C，5%CO2的环境中；D1天，加入IL-2、CD3单克隆抗体,每2-4天，计数细胞浓度，不断加入供者血清培养基及IL-2，使细胞浓度保持在1×106/ml，扩增后分瓶；12-14天后停止培养，回输患者或换置入锥形瓶中，以生理盐水洗涤，补充2%人血清白蛋白，然后悬浮于人血浆中，加入细胞冻存剂深低温保存。

3.4CIK细胞免疫分型测定

取同型对照CD3PEandCD8FITC,CD14FITC,CD19FITC,Vα24FITC，单克隆抗体CD3FITC,CD4FITCandCD56PE。分别于隔天取CIK(cytokine-inducedkillercell)细胞的培养物，加入检测抗体混匀，室温18~25℃避光放置15min后，加入OptilyseCLysingSolution，室温18～25℃放置10min，加入PBS液体混匀，5min后在流式细胞仪上测定分析。

3.5CIK细胞治疗过程

治疗前、后监测患者生命体征、血图分析、肝肾功能，治疗过程中予心电、氧饱和度监护。

结果

1.单倍体造血干细胞移植治疗结果

1.1造血干细胞数量

造血干细胞采集数量为：

1.2造血重建情况

以WBC>0.5*109/L持续2天为WBC植入标准；以无血小板输入，PLT>20*109/L连续7天为PLT植入标准。

患者1白细胞和血小板的重建均在d+13，患者2白细胞重建在d+9,血小板重建在d+11。

1.3单倍体造血干细胞移植副作用

两例患者移植过程中均出血性膀胱炎，予持续膀胱冲洗、抗炎治疗后好转。患者1曾出现大便培养奇异变形杆菌，患者2咽拭子培养见白色假丝酵母菌，经抗感染治疗后症状均痊愈。两例患者移植后均持续接受CSA抗排斥治疗，未出现GVHD。

1.4单倍体造血干细胞移植疗效

两例患者在结合CIK细胞治疗下，骨髓均持续完全缓解(completeremission,CR)，分别保持10个月及4个月的无病生存期。

2.CIK细胞治疗结果

2.1CIK细胞表型

CIK细胞表型：CD3+88.80%,CD3+CD4+22.0%,CD3+CD8+49.08%,CD3+(CD16+/CD56+)3.83%,CD3-CD19+0.57%,CD3-(CD16+/CD56+)1.0%。

2.2CIK细胞治疗情况

于患者1，分别于d+25,d+43,d+57,d+85,d+88,d+117,d+145,共7次反复输注供者来源的CIK细胞，细胞数量由106逐渐升至109。

于患者2，分别于d+30,d+74,d+78,共3次反复输注供者来源的CIK细胞，细胞数量每次为5*108。

2.3CIK细胞治疗效果

治疗后，患者1外周血免疫分型结果为：D+56，CD3+94.24%,CD3+CD4+57.06%,CD3+CD8+35.94%,CD16+/CD56+1.97%,CD19+2.56%,CD4/CD81.59。而D+117，CD3+72.55%,CD3+CD4+41.06%,CD3+CD8+30.59%,CD16+/CD56+67.10%,CD19+4.92%,CD4/CD81.34。

患者2治疗后外周血免疫分型：D+29，CD3+51.42%,CD3+CD4+37.50%,CD3+CD8+12.98%,CD16+/CD56+8.37%,CD19+3.39%,CD4/CD82.88。D+76，CD3+25.15%,CD3+CD4+8.26%,CD3+CD8+15.55%,CD16+/CD56+73.05%,CD19+1.50%,CD4/CD81.47。

根据流式细胞分析结果可见患者外周血中CIK主要效应细胞CD16+/CD56+数量明显增加，CD4/CD8比值下降，能够有效地清除残留病灶。

2.4CIK细胞治疗不良反应

治疗后1例患者出现局限性皮肤慢性排斥反应，双手糙皮病，干眼症，1例患者出现恶心，转氨酶、胆红素轻度升高等Ⅰ度排斥反应，经甲基泼尼松龙治疗后迅速恢复。所有不良反应均对正常生活无明显影响。

讨论

两例患者疾病均属自体干细胞移植后复发，选用常规的化疗方案无法再维持长时间的缓解状态。而骨髓移植后恶性血液病复发患者的治疗方法选择是有限的，选择单倍体异基因或脐血造血干细胞再次移植是紧急情况下有效的治疗方案，但是脐血干细胞存在数量不够，移植后造血延迟的缺陷，仍需在脐血库寻找来源；单倍体造血干细胞理论上均可找到供者，不存在干细胞数量问题，也不存在费时、伦理等其他情况，目前单倍体移植数量呈增加趋势，移植成功率与无关供者全相合移植相近。然而，针对自体或异体干细胞移植后复发病人，再次复发导致患者死亡是比例很高的，如何降低复发率仍然是一种重要的临床挑战。现临床上有三种主要的治疗方向：供者淋巴细胞输注(donorlymphocyteinfusion,DLI)、自然杀伤细胞(naturekillercell,NKcell)、CIK细胞。我们的本次研究是行非去T淋巴细胞的单倍体造血干细胞移植，然后结合供者源性CIK细胞来预防单倍体移植后的复发，使无病生存（DFS）时间延长，并试图找到合适CIK细胞剂量以保持GVL和GVHD的效应问题的平衡。

1．非清髓非去除T细胞的单倍体造血干细胞移植

单倍体造血干细胞移植是将HLA一条单体型相合的供者造血干细胞移植给受者。一个单体型为一条6号染色体的短臂上编码HLA的基因群的等位基因，两个单体型构成基因型，分别来自父亲和母亲，呈共显性表达。HLA不合/单倍型HSCT屏障是导致HLA半相合异体植入失败以及发生GVHD尤其是重度GVHD的根本原因[6]。Tamaki等[7]用氟达拉滨、马利兰、ATG行单倍体HSCT非清髓性预处理，未见移植排斥反应，很快获得完全供者嵌合，急性GVHD发生早，但限于Ⅰ-Ⅱ度。氟达拉滨的作用为抑制淋巴细胞的生长，用于单倍体HSCT，可腾空骨髓，也有免疫抑制作用。ATG有较强的免疫抑制作用，起到体内去T淋巴细胞的效应，减少排斥反应。干细胞体外去T优点主要是降低GVHD的发生率，然而考虑到去T的明显副作用：免疫重建慢、移植后感染发生率高、疾病复发率高[8-10]，我们仍采取非体外去T方式，同时加用氟达拉滨抑制免疫。以及应用G-CSF诱导骨髓采集物或外周血采集物中T细胞产生免疫耐受，促使其由Thl向Th2极化，能保证造血干细胞持久稳定地植活，植活速度快，而GVHD的发生率与异基因BMT相较并没有增加[11,12]。以经典CsA和短程MTX为基础，加用MMF和ATG增强免疫抑制强度，可有效降低中重度aGVHD的发生率[13]，以弥补非体外去T方式移植的不足之处，我们的病例表明造血干细胞迅速植入，同时移植后未见排斥反应。

2．DLI

1990年Kolb[14]率先使用DLI治疗异基因骨髓移植(allo-BMT)后慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)复发患者获得成功，肯定了DLI在治疗复发CML中的作用。根据近几年的研究成果[15]，认为DLI主要通过以下途径产生细胞毒作用，从而发挥移植物抗白血病作用：1)CD8+T细胞和NK细胞通过钙依赖的穿孔素途径直接溶解靶细胞；2)CD4+T细胞和CD8+T细胞通过缓慢的、非钙依赖的Fas配体-抗原途径诱导靶细胞凋亡；3)供者获得性的CD4+T细胞和CD8+T细胞均可呈现于受体造血祖细胞中，但只有CD4+克隆可通过细胞与细胞接触、释放细胞因子来杀伤靶细胞。对移植后复发的患者用DLI作过继免疫治疗细胞数大于1.0×108/kg，有利于疾病的再次缓解[16]。在移植后复发患者中，DLI对于CML的疗效最好，持续CR率可达60%-80%，多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)可达40%，急性髓系白血病(AML)，CR率仅为20%-30%，而急性淋巴细胞白血病(acutelymphoidleukemia,ALL)和骨髓增生异常综合征(Myelodysplasticsyndrome,MDS)的疗效较差，CR率不足20%[17-19]。Lewalle等[20]所进行的单倍体移植DLI的剂量相关性研究，发现在1×104CD3/kg/m的剂量上是安全的，不会诱发GVHD，但GVL效应不明确；而在移植后6个月以内治疗性的DLI1-5×105CD3/kg，频率达到每两周一次即可诱发GVHD。黄晓军等的一项研究表明在移植后复发的20例HLA不合患者中，G-CSF动员的外周血干细胞采集物输注后仅6例发生了Ⅲ～Ⅳ度GVHD，2年无白血病生存率是40%[21]。而其所进行的改良性DLI治疗，即G-CSF动员的供者外周血造血干细胞输注结合GVHD短程预防方案(CsA或MTX，10mg/周，2-4周)，可明显减少输注相关急性GVHD的发生，且不影响GVL作用，延长DFS时间[22,23]。我们的两例患者由于病种原因故未选用DLI治疗。

3．NK细胞

人的NK细胞具有抗原呈递细胞(Antigenpresentcell,APC)的功能。杀伤细胞抑制性受体(killcellinhibitreceptor,KIR)是一种释放抑制性信号的受体，主要是CD94/NKG2A,它可以抑制靶细胞的裂解，虽然其在病毒或肿瘤细胞的免疫应答中是无益的，但是对同种移植物的排斥或GVHD则是有积极作用的。1999年Ruggeri的研究第一次证实了NK细胞在HSCT中的GVL作用[24]，移植物抗宿主反应性NK细胞克隆(GVHdirectionalloreaetiveNKcellclone)介导了移植物抗宿主(GraftVersusHost)的NK细胞同种异基因反应性杀伤作用[24-27]。这种作用通过杀伤受者的抗原呈递细胞和白血病细胞，既增强GVL作用同时又抑制GVHD发生。近年来有研究发现供者NK细胞可能会使allo-HSCT越过GVHD屏障[28]。

在HSCT早期，首先重建的是高表达CD94/NKG2A、低表达KIR的NK细胞，随后，KIR的表达逐渐上升，CD94/NKG2A的表达逐渐降低，半年时逐渐转变为供者型，而此时，NKG2A的表达仍然明显高于供者的水平[29-31]。Nguyen[32]的研究显示，在体外去T淋巴细胞的单倍体、KIR配体不合的HSCT后很长一段时间，重建的NK细胞以KIR低表达、NKG2A高表达为主，由于这种细胞对肿瘤细胞的杀伤作用弱，是其模式高病死率(100%)、高复发率(70%)的主要原因。Shilling[31]等研究表明，在HSCT患者中减少NK细胞中KIR表达的比例，对异体反应的能力、NK细胞功能有潜在益处。Ruggeri的另一项单倍体不相合HSCT研究表明对于高危AML移植的5年无病生存率、移植排斥和急性GVHD等临床移植效果，输入GVH性的NK细胞的患者疗效显著优于未输者，而对ALL患者进行同样的移植治疗，结果加与不加GVH性的NK细胞的移植效果无差异[26]。在一些HLA单倍型HSCT后相合异源NK细胞治疗中，存在NK细胞GVH方向KIR不合的患者中可观察到更高的CR率及DFS时间[33,34]。

4．CIK细胞

德国Gütgemann的研究[35]认为CIK是Ⅱ型NKT细胞，因为它具有类似NK细胞的细胞杀伤毒性，但是表型却跟NK所表达的CD3-/CD56+不相同。同时培养过程中的所加入的IFN-γ引起CD4和CD8的比例下降，原因是由于IFN-γ抑制TH2细胞的生长，而TH2细胞的肿瘤杀伤活性是弱于TH1细胞[36]，于是抑制了CD4+细胞的扩增。Sangiolo等[37]的研究显示扩增后的CIK细胞有着对于主要HLA差别的同种异体反应性，分化为功能和表型不同的两个亚群，CD3+/CD56-细胞群保留有同种异体反应的能力，可能是导致GVHD的因素，而CD3+/CD56+保留有肿瘤杀伤的潜力。CIK细胞的主要细胞毒性效应细胞即是CD3+和CD56+，它们在正常人外周血细胞（PBPCs）中所占有的比例是很少的（1-5%）[35,36,38]。一些研究表明，从健康人标本，CD3+CD56+细胞可观察到扩增1000至6000倍，在40：1时，有最大的细胞杀伤效应[39,40]，这个比例被证明是可以非常有效的杀死肿瘤细胞的[41]。我们在治疗过程中保证CIK细胞剂量为每次108/kg。CIK细胞包括多种异质性的效应细胞，它们的溶细胞作用是非主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性的，而且也是非抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)依赖性的[42,43]。有研究表明在体外环境下，对于一些肿瘤细胞系或是新鲜分离的肿瘤标本，它有着强大的杀伤活性，包括AML、CML及B和T细胞性淋巴瘤[38,44-48]。他们作为免疫效应细胞所呈现的细胞介导的细胞溶解能力为介导胞浆颗粒穿透靶细胞膜的局部定向胞吐作用[49]。相较于DLI、NK细胞治疗，CIK细胞在体外培养时更容易大量扩增，对多种血液恶性疾病有着更广的效应谱及更强大的杀伤活性，不会对正常细胞产生破坏作用，而且不会加重或引起严重的GVHD。

造血干细胞移植后的阶段是免疫治疗的理想时机，因为此时体内的肿瘤负荷最小，GVL或是GVT效应容易达到更理想的疗效。此时输注供者源性的CIK细胞可以增强异基因移植的GVL或GVT效应，清除微小残留病灶。但是严重GVHD的高风险发生率仍是一个重要的限制其临床应用的因素，尤其是当供者和受者的主要HLA错配时[50]，这种并发症在半相合移植中会更加严重。众所周知，介导GVHD主要是T细胞，以及宿主的人类白细胞抗原[51]。CIK细胞中的CD8+成分在经过体外anti-CD3和IL-2刺激培养后，获得更少引起GVHD的可能性[52]。因为这些细胞可以特别地加强及促进植入，使植入的易化性独立于直接的宿主MHC同种抗原的识别作用，除外异基因CD8+及其产生IFN-γ的能力更少导致严重GVHD[53]。进一步讲，CIK细胞可以清除肿瘤细胞，但是不会对正常细胞产生杀伤作用[50]。

我们在此种治疗方案中已经表明，供者来源的CIK细胞可以在体外培养一定的时间，然后安全地输送给半相合HSCT的患者，并没有发生严重地并发症。得益于这种治疗，两例患者的无病生存期分别为10个月及4个月。并且，CIK细胞所导致的GVHD的程度是非常轻微的，并没有影响正常生活。

综上所述，半相合造血干细胞移植联合供者来源的细胞因子介导的杀伤细胞治疗自体移植后复发的血液恶性疾病是成功的，疗效是肯定的。考虑到供者来源的CIK细胞清除微小残留病灶的能力而不加重GVHD，这种治疗方法是有着重要的应用前景。这一治疗方案的有效性的深入研究显然将是CIK细胞未来临床研究的主要方向。

参考文献

[1]MaryM.Horowitz,RobertPeterGale,PaulM.Sondel,etal.Graft-Versus-LeukemiaReactionsAfterBoneMarrowTransplantation[J].Blood.1990,75(3):555-562.

[2]BeattyPG,CliftRA,MickelsonFM,etal.MarrowtransplantationfromrelateddonorsotherthanHLA-identicalsiblings[J].NEnglJMed,1985,313(13):765-771.

[3]SierraJ,StorerB,HansenJA,etal.Transplantationofmarrowcellsfromunrelateddonorfortreatmentofhigh-riskacuteleukemia:theeffectofleukemicburden,donorHLA-matching,andmarrowcelldose[J].Blood,1997,89(11):4226-4235.

[4]KirkR.Schultz.Haploidenticaltransplantationinchildren[J].Blood,2010,115(17):3420-3421

[5]TWU,DPLU.Unmanipulatedhaploidenticalbloodandmarrowtransplantation:whereweare[J].HongKongMedJ,2009,15(3Suppl3):27-30

[6]黄晓军，造血干细胞移植的临床免疫：现状与进展[J]，中国免疫学杂志，2009，25（7）：582-586

[7]TamakiH,IkegameK,KawakamiM,etal.SuccessfulengraftmentofHLA-haploidenticalrelatedtransplantsusingnonmyeloablativeconditioningwithfludarabine,busulfanandanti-T-lymphocyteglobulin[J].leukemia,2003,17(10):2052-2054

[8]DrobyskiWR,AshRC,CasperJT,etal.EffectofT-celldepletionasgraft-versus-hostdiseaseprophylaxisonengraftment,relapse,anddiseasefreesurvivalinunrelatedmarrowtransplantationforchronicmyelogenousleukemia[J].Blood,1994,83(7):1980-1987

[9]Henslee-DowneyPJ,AbhyankarSH,ParrishRS,etal.Useofpartiallymismatchedrelateddonorsextendsaccesstoallogeneicmarrowtransplant[J].Blood,1997,89(10):3864-3872.

[10]AversaF,ReisnerY,MartelliMF.Thehaploidenticaloptionforhigh-riskhematologicalmalignancies[J].BloodcellsMolDis,2008,40(1):8-12.

[11]HuangXJ,ChangYJ,ZhaoXY.InvivoinductionofT-cellhyporesponsivenessandalterationofimmunochemicalcellsofbonemarrowgraftsusinggranulocytecolony-stimulatingfactor[J].Haematologica,2004,89:1517-1524.

[12]陈育红，黄晓军，许兰平etal．G-CSF动员的异基因骨髓与外周血混合移植治疗血液系统恶性疾病[J]．中华医学杂志，2002，82(10)：1306-1309．

[13]韩伟，陆道培，黄晓军，etal.HLA配型不合造血干细胞移植GIAC方案100例临床分析[J]，中华血液学杂志，2004，25(8)：453-457

[14]KolbH,MittermullerJ,ClemmC,etal.Donorleukocytetransfusionsfortreatmentofrecurrentchronicmyelogenousleukemiainmarrowtransplantpatients[J].Blood,1990,76(12):2462–2465.

[15]LeisJ,PorterDL.UnrelateddonorLeukocyteinfusionstotreatrelapseafterunrelateddonorbonemarrowtransplantation[J]．LeukLymphoma,2002,4(3):9-17.

[16]DazziF,SzydloRM,CrossNC,etal,Durabilityofresponsesfollowingdonorlymphocyteinfusionsforpatientswhorelapseafterallogeneicstemcelltransplantationforchronicmyeloidleukemia[J].Blood,2000,96(8):2712-2716.

[17]SchleuningM.Adoptiveallogeneicimmunotherapyhistoryandfutureperspectives[J].TransfusionSci,2000,23(2):133-150.

[18]KolbHK,SchmidC,BarrettAJ,eta1.Graft-versus-leukemiareactionsinallogeneicchimeras[J].Blood,2004,103(3):767-776．

[19]SlavinS.Graft-versus-hostdisease,thegraft-versus-leukemiaeffect,andmixedchimerismfollowingnonmyeloablativestemcelltransplantation[J],IntJHematol,2003,78(3):195-207.

[20]LewalleP,TriffetA,DelforgeA,etal.Donorlymphocyteinfusionsinadulthaploidenticaltransplant:adosefindingstudy[J].BoneMarrowTransplant,2003,31(1):39-44.

[21]HuangXJ,LiuDH,LiuKY,etal.DonorlymphocyteinfusionforthetreatmentofleukemiarelapseafterHLA-mismatched/haploidenticalT-cell-repletehematopoieticstemcelltransplantation[J].Hematological,2007,92(3):414-417.

[22]HuangXJ,LiuDH,XuLP,etal.Prophylacticinfusionofdonorgranulocytecolonystimulatingfactormobilizedperipheralbloodprogenitorcellsafterallogeneichematologicalstemcelltransplantationinpatientswithhigh-riskleukemia[J].Leukemia,2006,20(2):365-368.

[23]HuangXJ,WangY,LiuDH,etal.AdministrationofshorttermimmunosuppressiveagentsafterDLIreducestheincidenceofDLIassociatedacuteGVHDwithoutinfluencingtheGVLeffect[J],BoneMarrowTransplant,2009,44(5):309-316.

[24]RuggeriL,CapanniM,CasucciM,eta1.RoleofnaturalkillercellalloreactivityinHLA-mismatchedhematopoieticstemcelltransplantation[J].Blood,1999,94(1):333-339.

[25]ParhamP,McQueenKL.Alloreactivekillercells:hindranceandhelpforhaematopoietictransplants[J].NatRevImmunol,2003,3(2):108-122.

[26]RuggeriL,CapanniM,UrbaniE,eta1.Effectivenessofdonornaturalkillercellalloreactivityinmismatchedhematopoietictransplants[J].Science,2002,295(5562):2097-2100.

[27]FaragSS,FehnigerTA,RuggeriL,eta1.Naturalkillercellreceptors:newbiologyandinsightsintothegraft-versus-leukemiaeffect[J].Blood,2002,100(6):1935-1947.

[28]DaviesSM,RuggieriL,DeForT,eta1.EvaluationofKIRligandincompatibilityinmismatchedunrelateddonorhematopoietictransplants,Killerimmunoglobulin-likereceptor[J].Blood,2002,100(10):3825-3827.

[29]ShillingHG,YoungN,GuethhinLA,eta1.GeneticcontrolofhumanNKcellrepertoire[J].Immunology,2002,169(1):239-247.

[30]赵翔宇，黄晓军.人类白细胞抗原单倍体不合造血干细胞移植后自然杀伤性细胞和T淋巴细胞杀伤抑制性受体表达的研究[J].中国实用内科杂志，2006，26(8)：579-582

[31]ShillingHG,McQueenKL,ChengNw,eta1.ReconstitutionofNKcellreceptorrepertoirefollowingHLA-matchedhematopoieticcelltransplantation[J].Blood,2003,101(9):3730-3740.

[32]NguyenS,DhedinN,VemantJP,eta1.NKcellreconstitutionafterhaploidenficalhematopoieticstemcelltransplants：immaturityofNKcellsandinhibitoryeffectofNKG2AoverrideGVLeffect[J].Blood,2005,105(10):4135-4142.

[33]LacerdaJF,MartinsC,CarmoJA,eta1.HaploidenticalstemcelltransplantationwitIlpurifiedCD34cellsafterachemotherapy-aloneconditioningregimen[J].BiolBloodMarrowTransplant,2003,9(10):633-642

[34]MillerJS,SoignierY,Panoskaltsis-MortariA,eta1.SuccessfuladoptivetransferandinvivoexpansionofhumanhaploidenticalNKcellsinpatientswithcancer[J].Blood,2005,105(8):305l-3057.

[35]GütgemannS,FrankS,StrehlJ,Schmidt-WolfIG.Cytokine-inducedkillercellsaretypeIInaturalkillerTcells[J].GerMedSci.2007,10,5:Doc07

[36]Schmidt-WolfIG,LefterovaP,MehtaBA,etal.Phenotypiccharacterizationandidentificationofeffectorcellsinvolvedintumorcellrecognitionofcytokine-inducedkillercells[J].ExpHematol,1993,21(13):1673–1679.

[37]DarioSangiolo1,EmanuelaMartinuzzi,MajaTodorovic,etal,Alloreactivityandanti-tumoractivitysegregatewithintwodistinctsubsetsofcytokine-inducedkiller(CIK)cells:implicationsfortheirinfusionacrossmajorHLAbarriers[J].InternationalImmunology,2008,20(7):841–848

[38]Schmidt-WolfIGH,NegrinRS,KiemHP,etal.UseofaSCIDmouse/humanlymphomamodeltoevaluatecytokineinducedkillercellswithpotentantitumorcellactivity[J].JExpMed1991,174(1):139–149

[39]LuPH,NegrinRS.AnovelpopulationofexpandedhumanCD3+CD56+cellsderivedfromT-cellswithpotentinvivoantitumoractivityinmicewithseverecombinedimmunodeficiency[J].JImmunol,1994,153(4):1687-1696.

[40]Schmidt-WolfIGH,LefterovaP,Johnston,etal.PropagationoflargenumbersofTcellswithnaturalkillercellmarkers[J].BrJHaematol.1994,87(3):453-458.

[41]Hans-JochemKolb,AntonSchattenberg,JohnM.Goldman,etal.Graft-Versus-LeukemiaEffectofDonorLymphocyteTransfusionsinMarrowGraftedPatients[J].Blood.1995,86(5):2041-2050.

[42]SchmidtRE,MurrayC,DaleyJF,etal.AsubsetofnaturalkillercellsinperipheralblooddisplaysamatureTcellphenotype[J].JExpMed.1986,164(1):351-356.

[43]LinnYC,HuiKM.Cytokine-inducedkillercells:NK-likeTcellswithcytotolyticspecificityagainstleukemia[J].LeukLymphoma.2003,44(9):1457-62.

[44]HoyleC,BangsCD,ChangP,etal.ExpansionofPhiladelphiachromosome-negativeCD3(+)CD56(+)cytotoxiccellsfromchronicmyeloidleukemiapatients:invitroandinvivoefficacyinseverecombinedimmunodeficiencydiseasemice[J].Blood,1998,92(9):3318–3327.

[45]AlvarnasJC,LinnYC,HopeEG,NegrinRS.ExpansionofcytotoxicCD3+CD56+cellsfromperipheralbloodprogenitorcellsofpatientsundergoingautologoushematopoieticcelltransplantation[J].BiolBloodMarrowTransplant,2001,7(4):216-222.

[46]BakerJ,VernerisMR,ItoM,etal.ExpansionofcytolyticCD8(+)naturalkillerTcellswithlimitedcapacityforgraft-versus-hostdiseaseinductionduetointerferongammaproduction[J].Blood,2001,97(10):2923-2931.

[47]LinnYC,LauLC,HuiKM.Generationofcytokine-inducedkillercellsfromleukaemicsampleswithinvitrocytotoxicityagainstautologousandallogeneicleukaemicblasts[J].BrJHaematol,2002,116(1):78-86.

[48]SconocchiaG,LauM,ProvenzanoM,etal.TheantileukemiaeffectofHLA-matchedNKandNK-TcellsinchronicmyelogenousleukemiainvolvesNKG2D-target-cellinteractions[J].Blood,2005,106(10):3666-3672.

[49]G.D.Schmidt-Wolf,R.S.Negrin,I.G.H.Schmidt-Wolf.ActivatedTcellsandcytokine-inducedCD3+CD56+killercells[J].AnnHematol.1997,74(2):51–56.

[50]MartinoIntrona,GianmariaBorleri,ElenaConti,etal.Repeatedinfusionsofdonor-derivedcytokine-inducedkillercellsinpatientsrelapsingafterallogeneicstemcelltransplantation:aphaseIstudy[J].Haematologica,2007,92(7):952-959.

[51]FlowersMED,KansuE,SullivanKM.Hematopoieticstemcelltherapy.Pathophysiologyandtreatmentofgraft-versus-hostdisease[J].Hematology/OncologyClinicsofNorthAmerica.1999,13(5):1091-1107.

[52]DrobyskiWR,MajewskiD,OzkerK,HansonG.Exvivoanti-CD3antibody-activateddonorTcellshaveareducedabilitytocauselethalmurinegraft-versus-hostdiseasebutretaintheirabilitytofacilitatealloengraftmentp[J].JImmunol.1998,161(5):2610-2619.

[53]Yong-GuangYang,JinQi,Min-GuangWang,etal.Donor-derivedinterferon-γseparatesgraft-versus-leukemiaeffectsandgraft-versus-hostdiseaseinducedbydonorCD8Tcells[J].Blood,2002,99(11):4207-4215.