甘草酸对糖尿病足大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响

甘草酸对糖尿病足大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响

狄建宁1宋文燕2张靖3

（1.银川市第三人民医院银川750004）

（2.银川市中医院银川750004）

（3.宁夏回族自治区人民医院心内科宁夏750001）

【摘要】目的：研究甘草酸对糖尿病足大鼠血清中炎性因子的影响。方法：对相应的大鼠进行腹腔注射STZ，运用足部注射真菌菌液的方式制作模型，采用ELISA法、WesternBlot法检测大鼠血清中TNF-α、IL-6的含量。结论：本实验初步论证了甘草酸对糖尿病足大鼠的抗炎作用。

【关键词】糖尿病足；甘草酸；炎性因子

前言

糖尿病足是糖尿病中常见的慢性并发症，该疾病具有病程长、治疗难以及高致残率、高致死率等特点【1】，并且患有该疾病的由于长期受到疾病的折磨，导致其会出现一些不良清晰，同时，他们还要承担交高的治疗费用，因此给糖尿病患者生活质量以及生命预后带来了严重的威胁。有相关研究表明，【2】该病的急性期是炎症因子活化最严重的时期，抑制了抗炎因子，进而出现了异常的炎症反应，并且所持续的时间及强度都比较大。经过大量研究报道，患有该疾病的患者其神经以及血管的均与炎症因子有关【3】。TNF-α和IL-6作为炎症过程的重要因素，在疾病的发展过程中具有非常重要作用，这已经引起相关人员的重视【4】。所以我们采用腹腔注射STZ以及足部注射真菌菌液的方式来制做大鼠模型，特此研究甘草酸对糖尿病足大鼠TNF-α、IL-6的影响。

材料与方法

1.实验动物：

选择100只雄性SD大鼠，进行饲养10周，死亡的有20只，存活的为80只，体重均在200±10g。

2.主要试剂

(1)链脲佐菌素(STZ)。(2)猪胃黏蛋白(Mucin,TypeⅢ)。（3）大鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)测定试剂盒。(4)大鼠白介素-6(IL-6)测定试剂盒。（5）兔抗鼠TNF-α、IL-6抗体。

3.实验药物

甘草酸，由上海宝曼生物科技有限公司提供。

4.建立糖尿病模型:制作方法,腹腔注射STZ溶液。将150mg的STZ与10ml柠檬酸钠缓冲液进行混合，制成含有15g/L的STZ溶液，对大鼠进行腹腔注射，一次注射量为50mg/kg。正常对照组采用的腹腔一次性注射中，体积不含0.1mol/L的STZ以及pH4.4的柠檬酸钠缓。在72h后,血糖大于16.65mmol/L的大鼠为成模大鼠。

5.糖尿病足模型的制作:在模型造后的第8周开始，将0.2ml的3%猪胃黏蛋白进行腹腔注射，分别注射C、D、E、F组，以此来降低大鼠的免疫力，随后对大鼠注射已经配制好的菌液。菌液的制作，（1）将6亿/毫升的尖端单孢子菌取5ml与10ml的鸡蛋清进行混合，（2）将6亿/毫升尖端单孢子菌、6亿/毫升铜绿假单胞菌，各取2.5ml后，和10ml蛋清进行混合,（3）同时将6亿/毫升的尖端单孢子菌、6亿/毫升的铜绿假单胞菌，进行混合，每个取2.5ml，随后和10ml蛋清相混合。按以上的三种方式制成相应的菌液。分别在C、D、E组大鼠的足趾部位进行注射，注射液为0.1ml的尖端单孢子菌菌液,。在F组大鼠足趾部注射0.1ml的尖端单孢子菌、铜绿假单胞菌的混合菌液。感染模型初步形成。

6.动物分组与用药：动物分为A、B、C、D、E五组，分别为正常对照组、糖尿病组、真菌注射组、甘草酸治疗组、真菌注射、甘草酸联合治疗组，每组16只。对以上大鼠均正常喂养7d，让所有大鼠适应新的环境，随后选取相应的大鼠注射STZ，制成模型。正常对照组(A)，对大鼠灌入等量的生理盐水，而D.、E组则灌入30mg/kg的甘草酸，每天一次。

7.血液的采取和血浆、血清的分离:将所有大鼠麻醉后实施剖腹，采取经腹主动脉血，10ml左右，1000r/min，离心10min，将所得出的血清、红细胞快速地分离。保存温度为-70℃下。

8.血清TNF-α，IL-6测定

（1）ELISA法：分别采用TNF-α及IL-6ELISA试剂盒进行检测。

（2）WesternBlot法：收集血液，过夜浓缩后分离血清，采用WesternBlot法检测TNF-α及IL-6含量。

9.统计学处理:计量资料利用计算机统计软件SPSS19.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较。

结果

1.一般情况:所有大鼠在注射STZ之后，次曰均出现多饮，多食，多尿及粪便增多情况，以多饮，多尿症壮明显，并随时间的推移，被注射大鼠的症状逐渐加重，第20d时糖尿病模型组的大鼠有精神萎靡、行动迟缓、皮毛暗淡、消瘦，乏力等情况，并发现该组大鼠饮水，小便量为正常大鼠的5倍，进食量是正常大鼠的2倍。而正常大鼠没有出现上述症状，尿便也正常。各治疗组的大鼠均好于模型组，均出现不同程度的"三多一少"症状。

2.大鼠血清TNF-α含量变化：正常对照组血清中TNF-α含量明显低于各模型组及治疗组，C组含量略高于B组（P<0.01），D、E组含量明显低于B、C组，但仍高于正常对照组（A组），见表1，图1。

3.大鼠血清IL-6含量变化：A组明显低于B、C、D、E组，差异及显著（P<0.01），D、E组低于B、C组，差异显著（P<0.05），见表2，图2。

两种检测方法得出的结论一致。

图1甘草酸对糖尿病足大鼠血清TNF-α的影响

与A组比较，Pa<0.05；与B组比较，Pb<0.05，与C组比较，Pc<0.05。

图2甘草酸对糖尿病足大鼠血清IL-6的影响

与A组比较，Pa<0.05；与B组比较，Pb<0.05，与C组比较，Pc<0.05。

讨论

随着糖尿病发病率的不断升高[5]，糖尿病足的发生率也呈上升趋势，是糖尿病的主要并发症。根据大量报道估计，糖尿病患者的一生中，患有糖尿病足的风险率高达20%左右[6]。尽管相应的部门努力控制糖尿病足的发生，但是足溃疡的发生率还是较高，降低患者的生活质量，提高病死率[7]。Jeffcoate等[8]在相应的报道中得出，糖尿病足患者的炎症反应较大，疾病可能与前炎症细胞因子有很大的关系。患有该疾病的患者局部炎症反应强度、时效等方面，均与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)有关，两者都出现增长的现象，继而使RANKL增加，导致破骨细胞成熟，造成骨质改变。甘草酸（Glycyrrhizin，GL）是甘草中最主要的活性物质，有研究资料表明[9]，甘草酸具有显著的非特异抗炎性作用，同时还能抑制糖尿病大鼠醛糖还原酶活性，发挥抗氧化应激，抗血小板聚集等作用。

本实验观察到，正常对照组动物血清中TNF-α及IL-6的水平明显高于模型组及药物治疗组，糖尿病机体处于高TNF-α及IL-6水平，说明炎性因子参与到糖尿病及糖尿病足的发生、发展过程中。甘草酸治疗组的TNF-α、IL-6水平明显低于非干预组，显示了甘草酸显著的抗炎作用。

综上所述，炎症因子在糖尿病足的发生发展中起着关键性的作用，甘草酸作为一种传统中药的有效成分，通过减少炎症因子水平，能够对糖尿病足的治疗起到一定作用。

参考文献：

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[7]王爱红,赵湜,李强,王鹏华,严励,杜玉茗,卞茸文,王战建,毛季萍,肖正华,马学毅,林少达,陈国昌,周迎生,许樟荣.中国部分省市糖尿病足调查及医学经济学分析[J].中华内分泌代谢杂志,2005,06:496-499.

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