分生孢子标本片的制作探索

分生孢子标本片的制作探索

李冰艳 王越 周婷婷

南京医科大学康达学院，江苏 连云港 222000

摘要：分生孢子形态观察是医学相关专业微生物中真菌学习的重要内容，为适应实践教学和学生学习需求，本实验室在传统小培养法的基础上通过改良菌种接种方法，同时将盖玻片更换为载玻片，一次性制得两张标本片，操作简单，保存时间长，可批量制备，方便教学，适合实验室使用。

关键词：大分生孢子；标本片；小培养法；真菌

近20 年来，随着抗生素类药物的滥用，抗肿瘤药物和免疫抑制剂等药物的大量使用，器官移植技术的发展、各种侵入性操作的增加，真菌感染率和致死率在全球呈上升趋势^{[1, 2]}。 真菌感染主要分为浅表真菌感染和深部真菌感染，其中浅表真菌感染由霉菌引起，为皮肤癣类疾病，早期诊断和治疗有利于清除病原菌，实现治疗目的。

目前，霉菌形态学特征仍然是临床上常用的浅表真菌感染的鉴别方法，主要有直接镜检法和培养法两种经典方法^[3]。显微镜下观察菌丝结构特点和分生孢子形态可确定和鉴别不同种类霉菌，医学院校临床相关专业微生物学习中真菌形态学观察是重要学习内容^[4]，所以标本片制作的好坏直接影响学生学习效果。常规培养方法如平皿培养和斜面培养制作标本片进行镜检会破坏霉菌结构而不能观察到完整形态，因此实验室常用小培养法观察霉菌形态，制备标本片用于教学使用^[1]。为方便教学，批量制备学生用标本片，本实验室在传统小培养法的基础上^[5]，通过改进操作方法制备标本片，现介绍如下。

材料

1.1菌种与培养基：石膏样小孢子菌标准菌株（中国科学院皮肤病研究所）；沙保弱培养基，常规方法配置

1.2试剂：乳酸石炭酸棉兰染色液（厦门海标科技有限公司）；阿拉伯胶（国药集团化学试剂有限公司）；无菌生理盐水等

1.3 仪器设备：通风橱；隔水式恒温培养箱（上海索普仪器有限公司）；生物显微镜（尼康E200数码生物显微镜）等

1.4 其他：灭菌后载玻片、滴管、湿盒、培养皿、解剖刀、试管、小镊子等

方法

2.1 培养基准备：制备平板培养基和斜面培养基，平板培养基厚度4 mm左右。

2.2 菌种传代：在通风橱内无菌操作，将标准菌株接种到斜面培养基上，置25°C恒温培养箱中培养3~4 d左右。

2.3 改良小培养法制作标本片：通风橱内操作，相关耗材及操作过程均应保持无菌，使用过程中使用器材用常规方法提前进行消毒灭菌。步骤如下：a.取培养3 d后的斜面培养基，加入无菌生理盐水约一滴管，洗下真菌菌落；b.用无菌解剖刀将平面培养基切割成4 mm ×4 mm × 4 mm左右的小方块；c.取灭菌后的载玻片，将切割好的培养基置于玻片中央；d.加一滴菌液于小方块培养基上并吸走菌液后置于放有浸水海绵的湿盒中；e.另取一张无菌载玻片置于方块培养基上方，使两张玻片呈平行状态（图1）；f.同样的方法制备更多；g.将湿盒置于25°C恒温培养箱中培养。

2.4染色和制片：a.培养过程中每日肉眼观察真菌生长状况，当看到培养基周边有真菌出现时停止培养；b.在通风橱内取出载玻片弃去小培养基，用记号笔在载玻片背面圈出真菌范围，通风橱内晾置；c.待玻片干燥后滴加乳酸石炭酸棉兰染色液覆盖住菌膜，通风橱内放置；d.染色约2~3 h后，蒸馏水冲净染液，吸水纸吸去多余水分，高倍镜下观察，将实验结果较好者封片。

结果

菌丝和孢子被染成蓝色。低倍镜下可见大量菌丝和孢子交织成团围绕培养基四周分布。油镜下可见大分生孢子由多个细胞组成，壁薄，呈纺锤形或梭状，孢子多与菌丝相连，偶有单独大分生孢子分布，有4~6个分隔（图2）。标本背景几乎无杂色，边界清晰，形态完好，结构典型，适合做教学示教使用。制作的标本片已保存六个月之久，依然完好。

图1 图2（×1000）

讨论

传统小培养法制作标本片，无论用接种钩还是接种环取菌接种于小培养基周边，都可能导致真菌接种不均匀且控制操作。采用改良接种法制作标本片，将菌落溶于生理盐水制成菌液后用滴管滴于小培养基上，真菌分布均匀，操作方便；将传统的盖玻片换成载玻片盖于小培养基上，可一次性制得两张标本片。所得标本边界清晰，形态典型，保存时间长，制备容易，一般实验室即可制备，适合教学单位自己制备，加之学校具有数码显微拍照技术将所得标本拍照保存，用于教学交流，方便学生学习。但在实际操作中也发现一些问题，如上方的载玻片真菌不易附着，使得所得标本中菌丝和孢子相对较少，个别甚至无；常规制作的沙保弱培养基在培养箱中一段时间后可能发生培养基软化不能弃去留在载玻片上，最后导致染色背景有杂色，不利于观察；染色时发现菌丝着色困难等等，需要进一步研究改进。

形态学观察是微生物实践教学的重要内容，通过实际操作摸索，改进传统制片，采用更简单更快捷的方式制得标本片，获得典型形态，有利于实践教学的顺利开展。

参考文献

[1] 蒋幸新, 焦梅, 徐新艳. 改良小培养法及制备真菌标本片的临床应用. 实用医技杂志. 2013. (10): 1093-1094.

[2] 周婷婷, 付玉荣, 伊正君. 真菌感染诊断方法的研究进展. 中国病原生物学杂志. 2015. (12): 1151-1153+1158.

[3] 杜银香. 霉菌教学标本片的制作及体会. 湖北民族学院学报(医学版). 2011. (04): 69-70.

[4] 宋汶辉, 施亚娟, 陈萌. 真菌检验技术在临床中的重要性与技术改革发展. 医药前沿. 2012. 02(7): 357-357.

[5] 楼永良．临床微生物学检验技术实验指导. 北京：人民卫生出版社,2015.

作者简介：李冰艳（1989-），女，河南周口人，南京医科大学康达学院基础医学部病原生物学与免疫学教研室助理实验师，硕士研究生，主要从事微生物、免疫和寄生虫学的实验教学与研究工作。

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