探讨 FER时间分辨荧光免疫层析检验的构建  

探讨 FER时间分辨荧光免疫层析检验的构建  

高军

山东省邹平县妇幼保健计划生育服务中心（邹平县妇幼保健院） 256200

摘要：构建FER时间分辨荧光免疫层析检测法，并在临床上加以应用。将FER抗体及兔IgG在硝酸纤维素膜上包被，利用荧光微球对抗FER单克隆抗体及兔IgH进行标记，并将其作为检测线及质控线制备荧光免疫层析时使用的试纸条。FER时间分辨荧光免疫层析检测法的灵敏度可以达到0.5ng/ml，批内CV达到3.6-4.6%，批间CV达到3.8%-5.0%，平均回收率达到100.6%，具有良好的热稳定性。将其与电化学发光分析技术相比较时，相关系数可达到0.8899,。正常参考值范围男性是100-350ng/ml，女性是40-260ng/ml。利用这种方法建立的FER时间分辨荧光免疫层析检验灵敏度较高，且检测十分可靠。

关键词：FER、时间分辨荧光免疫层析、检验

FER即铁蛋白，是一种脱铁蛋白组成的大分子结构糖蛋白，出现FER增高多在以下几种情况中见到：首先，体内贮存的铁过多，如人体长期接受输血或是比例不恰当的铁剂进行治疗；其次，恶性肿瘤患者；再次，急性感染及炎症患者；第四，肝脏疾病，如肝硬化及肝坏死等等。出现FER降低多在以下几种情况下出现：首先，缺铁性贫血，具有明显的早期诊断价值；其次，营养不良或是严重慢性肝病影响^[1]。由于肝脏中含有的FER占据体内储存铁的三分之一左右，而血循环过程中FER又很容易被肝细胞所清除，因此，可以将FER作为肝病的血清学标志物看待。病毒性肝炎发病时，肝组织会出现炎症，肝细胞也会出现坏死，这时血清FER会升高。对于良性肝脏疾病测定的FER值可以将其作为肝脏中铁过载的重要类型指标。原发性肝癌患者的FER值往往会出现急剧升高，成为原发性肝癌排名第二位的血清学标志物，尤其对于AEP阴性患者来说^[2]。另外，一些实体恶性肿瘤也会合成FER或是分泌FER，因此，可以将FER作为一些恶性肿瘤的辅助诊断指标，如乳腺癌、淋巴癌等等，它与肿瘤转移有着密切的关系^[3]。因此，建立FER检测方法对于早期诊断治疗肝病、肿瘤，或是对肿瘤预后也有一定意义。本文利用时间分辨荧光免疫层析法建立对FER快速检测的试剂盒。

材料及方法

1.1标本

303例健康体检对象的血清，体检对象排除有心肝肺肾等疾病，年龄26-59岁，平均年龄（43.24±2.31）岁。另选取16例肺病患者血清及109例肝病患者血清。

1.2试剂及仪器

抗FER单克隆抗体、FER标准原液、时间分辨荧光纳米微粒、兔IgG、羊抗兔IgG抗体、吸水纸、底板、硝酸纤维素膜、结合垫、卡壳、乙二胺四乙酸。FER国家标准品，划膜稀释液、样品稀释液、HG-98免疫荧光检测仪、冻干机。

1.3FER参考标准品配置

将FER标准原液进行稀释，配置成10/50/100/500/1000ng/ml的标准溶液，利用FER标准品对各标准点的浓度进行校准，在4℃条件下进行保存，1ml/瓶分装。

1.4NC膜制备

取抗FER单克隆抗体及兔IgG利用划膜稀释液将其稀释至工作浓度，利用喷金划膜一体机以2.0ul/cm均匀连贯在NC膜上包被，并将其烘干密封，在-20℃条件下进行保存。

1.5样品垫制备

取FER单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体按照EDC活化羧基偶联法将其在纳米荧光微球上标记，利用喷金划膜一体机利用2.0ul/cm彭亮均匀喷涂在样品垫上，并将其烘干密封。

1.6测试卡条制备

将NC膜及结合垫、吸水纸、底板组装呈测试用的卡条，并将其密封，放置在-20℃的条件下保存。

结果

2.1FER抗体划膜浓度选择

选择不同的浓度，浓度分别为0.125/0.25/0.5/1.0/2.0/4.0/8.0mg/ml，得到在2mg/ml时检测得到它的最高浓度点结合率已经趋于饱和，可以实现良好的免疫反应条件。

2.2抗体标记比例的选择比较

利用200nm的时间分辨荧光微球开展抗体标记活动，在标记过程中开展比例不同的抗体标记比较。结果显示，当荧光微球与抗体的比例保持在1:1至4:1的范围内，其综合指标良好。但是从成本角度考虑，选择4:1是抗体标记时所得到的最佳比例。

方法

床旁检测是现今检验医学发展的新兴领域，它的主要优势在于快捷性与灵敏性。随着现今它的应用领域及需求不断扩展，床旁检测免疫分析法从乳胶、荧光燃料等标记示踪技术，逐步向着更好特异性及灵敏度方向的定量技术发展^[4]。胶体金、乳胶床旁检测是依据颜色深浅展开判断，它的灵敏度不高，只能进行定性检测及半定量检测。而荧光染料床旁检测的荧光强度十分有限，它的灵敏度也不高。普通荧光微球床旁检测具有较高的荧光强度，但普通荧光拥有较高的背景，干扰因素很多，它的特异性也不是十分明显。本次研究中利用的时间分辨荧光免疫层析法结合了时间分辨荧光、纳米微粒及免疫层析等三种方法的优点，利用时间分辨荧光微球利用镧系元素螯合物作为标记示踪，荧光这时激发的波长范围很宽，发射光谱峰则在范围上较为狭窄，属于类线广谱，使得本底荧光强度大大降低，进而使得灵敏度得到提高。激发光及发射光的stokes位移较大，激发光不能直接达到光电接受器上，使得激发光的杂散光影响被解决，也使得检测的灵敏度及特异性大幅度得到提高，荧光也有着较长的寿命

^[5]。通过对测量时间进行延缓，短寿命背景荧光衰变得到消失后，再对特异性的荧光进行记录，避免本底受其干扰。

参考文献：

[1]安清聪,徐娜娜,张春勇,潘洪彬,李美荃,陈克嶙,郭荣富.不同水平乳铁蛋白对滇撒配套系仔猪生产性能、小肠形态学和机体抗病能力的影响[J].畜牧兽医学报,2015,46(12):2206-2217.

[2]杨彩云,曹长乾,蔡垚,张同伟,潘永信.铁蛋白表面修饰及其应用[J].化学进展,2016,28(01):91-102.

[3]李志鹏,刘庆友,石德顺.铁蛋白纳米颗粒应用于生物医疗领域的研究进展[J].生物技术通报,2015,31(10):38-47.

[4]庞晓楠,弘笑,魏璇,陈喜文,刘佳,陈德富.乳铁蛋白的理化性质及其重组表达系统的研究进展[J].遗传,2015,37(09):873-884.

[5]李美良,蒲彪,赵广华.铁蛋白:一种新型矿质元素营养强化剂载体[J].食品科学,2014,35(13):326-333.