HPLC波长转换法同时检测双黄连口服液中 4种有效成分的含量

HPLC波长转换法同时检测双黄连口服液中 4种有效成分的含量

王颖

哈药集团三精制药有限公司 150000

【摘 要】HPLC波长转换法是基于高效液相色谱法所采取的新型药品成分检测方法，在实际功能贯彻环境中，能够通过有效的波长条件明确试液环境中成分的含量和各方面参数，更可以明确整体试验环境的稳定性，为后续相关药品产业提供良好且有效的稳定性评判基础。本文针对双黄连口服液中四种有效成分含量检测展开分析，通过HPLC波长转换法确定实验步骤和结果同时，期望以有效的流程数据和识别条件巩固后续药品含量环境，并为之提供良好参照。

【关键词】HPLC波长转换法；双黄连口服液；有效成分；含量

双黄连口服液是现有临床医疗体系中常见的药品，其主要具备抑菌、抗病毒和增强免疫力的作用，在实际功能贯彻环境中本应该具备非常广泛的适用优势，但由于传统制备工艺的落后，导致药品在新型药品的市场冲击下受到严重影响。故而，依据有效手段确定双黄连口服液中有效成分的含量，既可以明确溶液含量有效性，更可以为后续市场竞争提供详细参数化的整改条件。

试验仪器与实验药品

实验仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、二极管阵列检测器、柱温箱、可控温自动进样器、HPLC泵、0.45μm滤膜和过滤器、紫外分光光度计、电子分析天平。

试验药品：双黄连口服液、对照品（绿原酸、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩素）、色谱纯溶液（甲醇、乙腈）、去离子水、磷酸分析纯。

试验方法及结果

色谱条件

试验过程中流动相的选用分为甲醇、乙腈和0.1%磷酸水溶液，流速为1.0mL/min，依据色谱柱（C18柱）条件，柱温为30°C，进样器温度为5°C。由此可得检测波长在0~8min时间内为328nm，之后稳定在276nm条件。

对照品制备

依据实验分析目标，针对绿原酸、连翘苷、汉黄芩素各取2mg，而后分别置于标准容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至标准刻度后，摇匀取得各成分标准储备液，以便后续实验对比参照使用。其次，针对黄芩苷对照液的制备，需要称取10mg融入量瓶中，同时加入甲醇溶液进行稀释，确保抵达至标准刻度同时，制备成浓度较高的标准储备液。而后，针对各对照液体应进行冰箱避光保存，在使用前采取原有浓度的甲醇溶液稀释至需要浓度。

样品制备

精密称取双黄连口服液1mL，而后置于精密容量瓶中，待通过甲醇溶液稀释至试验浓度后，摇匀取0.45μm滤膜过滤，取得滤液便可作为试验样品。

专属性试验

依据对照品溶液的特性，在展开试验过程中应当称取各溶液100μL（其中汉黄芩素选取200μL），均置于1mL精准容量瓶内，通过甲醇溶液稀释至刻度条件，在进行摇匀取得混合对照品条件。之后，针对混合对照品溶液和试验溶液进行提取，利用高效液相色谱法针对溶液特性进行分析，可得出相应数值条件。其中连翘苷、绿原酸、黄芩苷和汉黄芩素保留时间分别为15、6、17、24min，由此可见分离度良好，不受其他成分干扰测试结果。

精密度试验

精密选取混合对照品溶液与对照品溶液各15μL，依据需求情况进样5次，可测得其中混合溶液与对照品溶液环境中成分的变化比率，并可以得知仪器在精密度方面满足实际试验的基础需求，并能够为后续工作提供扎实数据基础。

检测限与定量限

精密量取线性项下对照品储备液定量稀释，以信噪比S/N 为3 :1，测得绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素的检测限分别为3,5，1,0.5ng; 以信噪比S/N 为10: 1,测得绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素的定量限分别为7,10,3,0.8 ng。

重复性试验

精密称取同一批号5 份样品，按样品制备方法制备进样，记录峰面积，结果绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素的峰面积RSD 分别为 2.67 %、1.03 %、2.13 %和1.39 %。

稳定性试验

取同一样品溶液，分别于0,2,4,8，12, 24h 进样测定，绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素的峰面积RSD 分别为1.93 %、1.65 %、2.22 % 和1.87 %, 表明样品溶液在24 h 内稳定。

回收率试验

取已知含量的样品溶液，分别精密加入含绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素的对照品溶液高、中、低3 种质量浓度，制备测定并计算回收率，结果见表1。

表1 回收率实验（n=6）

样品测定

分别取不同厂家不同批次的双黄连口服液，制备供试品溶液，并按上述色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，根据外标法计算绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素含量。

试验成果论述

样品的制备

用50% 甲醇溶解样品，分别观察了不同频率超声波处理后绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素溶出率的差别，结果显示不同频率超声处理未能增加4 种指标成分的溶出率，从节省时间和能源角度出发，本实验采用50% 甲醇溶解样品后直接检测分析。

分析波长的选择

通过对绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素四种标准品在190~800 nm紫外可见光谱扫描，结果表明绿原酸在326 nm有较强吸收,连翘苷在226 nm有较强吸收，黄芩苷和汉黄芩素在278 nm 波长处有较强吸收，由于连翘苷和汉黄芩素在样品中含量较低，而绿原酸和黄芩苷在样品中含量较高，为了兼顾4 种成分的同时测定，增加方法的灵敏度和准确度，并减少干扰，本实验采用波长转换点检测方法，分别选择4 种成分的各自最大吸收波长作为测定波长。

流动相的选择

双黄连制剂为中药复方，成分组成较复杂，而且绿原酸、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩素4 个指标成分极性差别较大，曾采用梯度洗脱，绿原酸与邻近组分不能有效分离，连翘苷和黄芩苷也未能完全分离开来，且连翘苷和黄芩苷分离效果甲醇系统明显优于乙腈系统，但乙腈系统中4 个指标成分峰型对称，优于甲醇系统。因此，本文最终采用梯度洗脱的方法， 在0~8 min 乙腈的比例为12%,使绿原酸和邻近组分达到基线分离，8~20 min 乙腈的比例保持不变， 通过增加甲醇浓度来提高洗脱和分离效果，使得连翘苷与黄芩苷基线分离，20~27min提高乙腈的浓度, 使汉黄芩素达到基线分离。实验结果表明双黄连口服液中4 种标志成份峰分离度良好，峰形对称，与相邻峰达到基线分离。

结语

双黄连口服液内部成分的有效分析与有效检测方法的确定，既满足了现有药品市场在后续发展中具备药性可持续化的基础条件，同时也巩固了现有药品检测环境的步骤方法，确定了后续功能延伸方面的参照标准，以便相关药品厂家有效把控药品质量条件。故而，此次试验在实际开展方面具备一定延伸优势，既方便了整体药品市场的检测发展条件，并基于完善的数据统筹优势，提出了更具备针对性的制备前提，为后续药品功能性发展打下良好基础同时，更确保了整体药品市场经济的稳定性，以便后续其他药品发展具备参照条件。

参考文献

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[3]朱红艳. HPLC/MS法检测双黄连口服液中有效成分的分析[J]. 临床医药文献电子杂志, 2017(62).