YAP抑制剂在上皮性卵巢癌动物模型中的作用研究

YAP抑制剂在上皮性卵巢癌动物模型中的作用研究

万颖 孟焕然

宁夏医科大学总医院心脑血管病医院 宁夏 银川 750004

摘要：目的：探究YAP抑制剂在上皮性卵巢癌动物模型中的作用。方法：BALB / c-nu雌性裸鼠腋窝皮下接种HO8910、SKOV3细胞，建立裸鼠成瘤模型，分为A、B两组，将A、B两组分别给予三种给药方案，并设立对照组A（生理盐水）、对照组B（生理盐水），评价PPIX、TP对肿瘤体内生长的抑制作用，以及PPIX+TP的联合治疗疗效。结果：用药后，A1、A2、A3、B1、B2、B3组皮下移植瘤体积均较对照组A、B减小，P<0.05；A1、A2、A3、B1、B2、B3组分别与对照组A、B比较，YAP蛋白表达均较前减少，P<0.05。结论：YAP抑制剂PPIX、TP（顺铂+紫杉醇）均对肿瘤生长有抑制作用，但PPIX联合TP方案治疗，抑瘤效果更佳，提示YAP作为干预靶标在卵巢癌分子靶向治疗中有一定潜在价值。

关键词：卵巢癌；YAP；YAP抑制剂

卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科恶性肿瘤首位。上皮性卵巢癌起病隐匿，缺乏早期、有效的诊断方法，多数患者待有临床症状出现时就医，已发生晚期转移，术后易复发，所以探索寻求卵巢癌更加经济有效的诊断治疗方法，对于卵巢癌的诊断治疗改善预后具有重要意义。Hippo-YAP信号转导通路可通过抑制YAP活性，诱导哺乳动物细胞增长，促进肿瘤的发生。通过评价YAP抑制剂PPIX作用于荷瘤鼠的治疗效果，探讨以Hippo-YAP作为干预靶标在卵巢癌分子靶向治疗中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1材料

人上皮性卵巢浆液性囊腺癌细胞HO8910及SKOV3，购自北京中国医学科学院实验动物中心；40只BALB / c-nu雌性裸鼠，4～6周龄，体重16～19g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在宁夏医科大学实验动物中心饲养（SPF级），青链霉素、10%胎牛血清的1640培养基（GBICO公司），顺铂、紫杉醇、PIXX（购自宁夏医科大学总医院药剂科），YAP抗体（一抗）、山羊抗体（二抗）、内参β-actin、5%脱脂牛奶购置于Abcam公司

1.2方法

消毒裸鼠皮肤，1mL注射器抽取0.2mL细胞悬液接种于裸鼠腋窝皮下，两组卵巢癌细胞各接种20只裸鼠，接种后观察裸鼠精神状态无异常，继续于SPF环境下饲养。当肿瘤体积达到100-200mm³时，将两种细胞接种的荷瘤裸鼠根据肿瘤体积随机分为对照组和实验组，每组5只，共8组。

对照组A、B：生理盐水 10mg/kg，每日给药1次

实验组A1、B1：PPIX 10mg/kg，每日给药1次

实验组A2、B2：顺铂 5mg/kg+紫杉醇5mg/kg，每7日给药1次

实验组A3、B3：顺铂 5mg/kg+紫杉醇5mg/kg，每7日给药1次；PPIX10mg/kg，每日给药1次，各组用药持续21天。

采用裂解液提取各组细胞的蛋白质，等量上样，SDS-PAGE电泳分离，半干转膜，脱脂奶粉封闭3h后，加入一抗，室温孵育2h后，放于4℃继续过夜，TBST洗4次；加入二抗，室温孵育2h，TBST洗后，ECL发光检测，试验重复3次。

1.3统计学方法

结果采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果用均数±标准差表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPIX、TP（顺铂+紫杉醇）、PPIX联合TP对裸鼠移植瘤生长的影响

结果显示，用药后，A1、A2、A3、B1、B2、B3组皮下移植瘤体积均较对照组A、B减小，P<0.05，见表1与表2。

表1 各组药物对HO8910裸鼠移植瘤生长的影响（x±s,mm³）

表2 各组药物对SKOV3裸鼠移植瘤生长的影响（x±s,mm³）

2.2 YAP蛋白的表达情况

结果显示，用药后，A1、A2、A3组YAP蛋白表达较对照组A减少，P<0.05；A1与A2组比较YAP蛋白表达无明显差异；A3 YAP蛋白表达较A1、A2组减少，P<0.05。B1、B2、B3组YAP蛋白表达较对照组B减少，P<0.05；B1与B2组比较YAP蛋白表达无明显差异；B3 YAP蛋白表达较B1、B2组减少，P<0.05。A组与B组比较YAP蛋白表达无明显差异。

3 讨论

Hippo-YAP信号通路主要通过与细胞核内相应转录因子的结合调控下游目的基因的表达，TEAD或YAP的结合会抑制YAP促进细胞生长等功能，对细胞生长发育起到重要调控作用。Hall等^［1］通过分析发现YAP的表达水平与患者的5年生存率相关，YAP细胞核表达水平高者及细胞浆中磷酸化YAP低表达者，其5年生存率降低50％。Steinhardt^［2］曾对54例患者的肿瘤组织及癌旁组织样本进行YAP蛋白检测，推测YAP极有可能起到激活癌基因的作用。同样Zhao B^［3］在98例胃癌组织中发现YAP与凋亡抑制因子的表达呈正相关，Survivin通过抑制胃癌中细胞凋亡及调节细胞有丝分裂的发生参与胃癌的发生、发展及转移。黄维等^［4］通过研究发现54％的肝癌组织YAP表达呈强阳性，在细胞核中表达率极高， YAP的异常表达将会促进肿瘤的发生发展。对于乳腺癌的研究，马全富等^［5］也发现YAP具有潜在的致癌性。

由此可见，YAP是Hippo信号通路的主要效应分子，寻找以YAP为靶点的抑制剂可能对肿瘤的发生发展有重要意义。本课题中研究显示，PPIX对卵巢癌皮下移植瘤有一定抑制作用，PPIX联合TP有明显的联合给药协同作用，使移植瘤生长更加缓慢，检测移植瘤内YAP蛋白水平也随之降低，提示YAP抑制剂在动物体内具有一定的抗肿瘤作用。

参考文献

[1]Hall C A，Wang R，Miao J，et al．Hippo pathway effector YAP is an ovarian cancer oncogene [J]．Cancer Res，2010，70（21）：8517－8525．

[2]Steinhardt A A，Gayyed M F，Klein A P，et al．Expression of Yes －Associated Protein，YAP，in common solid tumors ［J］．Hum Pathol，2008，39（11）：1582－1589．

[3]Zhao B，Wei X，Li W，et al．Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control［J］． Genes，2007，21（21）：2747－2761．

[4]黄维. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在卵巢癌中的研究进展[J]. 肿瘤学杂志, 2018, 24(7):717-721.

[5]马全富, 徐檬, 颜彬, et al. 上皮性卵巢癌组织中YAP1的表达及临床意义[J]. 武汉大学学报(医学版), 2019.