海藻硫酸多糖的利用与生物转化

海藻硫酸多糖的利用与生物转化

刘一洲，甘馨怡，陈启煊，

理学院生物系，汕头大学，汕头， 515063

摘 要：海藻多糖作为海洋生物质中重要的组成成分，能将其有效、可持续的利用转化，是未来极具能源应用潜力的生物质能。本文主要介绍了海藻多糖，特别是硫酸多糖的理化性质和相关作用，同时详细叙述了目前研究所采用的海藻多糖水解方法及其优劣，并在此基础上分析探讨了海藻多糖在转化生物能源过程的潜力。

关键字：海藻多糖，水解，生物能源，生物质利用

Utilization and Bioconversion of Sulfated Polysaccharide from Algal Biomass

LIU, Yizhou, GAN Xinyi, CHEN Qixuan

Department of Biology, College of Science, Shantou University

Shantou 515063, China

1 多糖

多糖是由长链单糖单元通过糖苷键结合在一起的组成的聚合碳水化合物分子，并且在水解时产生单糖或寡糖组分，它们具有从线性到高度支化的结构范围^[1]。多糖在自然界分布极广，在各种功能结构的构成上有着十分重要的地位，如具有储存多糖功能的淀粉和糖原，和具有支持结构功能的纤维素和几丁质等^[2]，部分多糖亦会通过共价键与蛋白质构成蛋白聚糖发挥生物学功能，如作为机体润滑剂^[3]、识别外来组织的细胞、作为血型物质的基本成分等；或与脂质结合成糖脂质，这些糖称为复合糖，是构成细胞的材料之一^[4]。

海藻多糖无甜味，且多为无定形粉末，一般不具有还原性，但有旋光活性，在水中溶解度常随分子量的增加而降低^[2]。多糖通常非常不均匀，它含有重复单元的轻微改性，由于它们结构的多样性(如图1)，这些大分子可具有与其单糖结构单元不同的性质，随着聚合度的增加，多糖的性质与单糖相差越来越大。它们可能是没有固定形状的，甚至有的多糖还具有不溶于水的特殊性质。同时海藻多糖不能通过细胞膜，不可以直接被吸收，它必须先水解成单糖才可被细胞吸收和利用。

图1 多糖的来源及应用领域示意图^[5]

2 硫酸多糖及其水解利用

硫酸多糖是一类多糖的硫酸化衍生物，是一种由多糖分子链中的单糖分子上的羟基经硫酸化得来的多功能活性物质，目前包括天然提取的硫酸多糖和化学合成的硫酸多糖两种。海洋藻类多糖以及海洋动物多糖是目前重要的天然硫酸多糖来源。大分子硫酸多糖的单糖组成复杂，糖组分不均一，通常含有糖醛酸（醛糖中分子末端的羟甲基被氧化为羧基的产物）、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖等。

无论是天然提取的，还是经硫酸化修饰获得的硫酸多糖，都具有多种生物活性，且硫酸多糖类药物在临床使用时具有用量少、副作用小等优点，都具有抗病毒活性^[6]、抗凝血活性^[3]、抗肿瘤活性^[7]以及抗氧化活性等生物活性，因此硫酸多糖的水解产物在医药、营养食品、药用化妆品和功能性食物等领域具有广阔的应用前景。另外一方面，在前期调查发现硫酸多糖由于其结构中硫酸基团的存在，容易引起其生物利用效率较低，从而影响海藻多糖的转化效率，也极大的制约了利用海藻多糖作为碳源株转化生物能源物质的效率，因此研究硫酸多糖的脱硫过程，提高海藻多糖的生物利用率就显得格外重要。一般来说，硫酸多糖水解通常有以下方法：

化学降解法

化学法降解所需试剂低廉易得，对该法的研究也最为广泛。在反应体系中加入使糖链断裂的试剂, 促进相对分子质量降低, 降解程度与多糖硫酸酯的结构及降解试剂性质有关。其中酸法降解为常用的化学降解法, 即向多糖溶液中加入酸溶液并在一定温度下反应以达到降解效果，所用的酸为质子酸，无机酸类有盐酸、硫酸、硝酸等, 有机酸类有甲酸、乙酸、草酸等^[8]。另外，酸的浓度、反应温度和反应时间均为影响多糖降解程度的重要因素, 不同的酸解条件得到的多糖分子量也不同，从而对其表现的生物活性也有影响。酸法水解多糖后还需对降解产物进行脱盐纯化处理，脱盐处理可根据分子量大小采用超滤膜，也可通过不同类型的脱盐柱进行该操作。最初，人们主要用浓硫酸和无水乙醇进行脱硫，但此法反应条件剧烈，容易引起多糖构象的改变，产生抑制产物；再者酸法水解过程大部分都是在高温条件，糖苷键的断裂基本上是随机的，降解产物分子量分布较大，给分离纯化带来一定的困难。

有机溶剂脱硫酸基法利用酸脱硫酸根易引起糖苷键的断裂，而有机溶剂脱硫酸基则不易引起糖苷键的断裂，也不易引起多糖分子结构改变，这对多糖的结构分析有重大意义。Miller等将无水ι-卡拉胶置于无水二甲亚砜溶液中，加入吡啶、1,2,4,5-苯四酸和一种能与硫酸根结合的化合物如三氧二锑或氟化钠等进行反应，120 ℃作用3 h，可脱去硫酸多糖的硫酸根。如选择三氧二锑进行反应，可获得全脱硫产物；选择氟化钠反应，可获得4-脱硫的产物

^[9]。

物理法辅助化学法

部分研究采用物理法辅助化学法对多糖硫酸酯进行降解，通过物理作用增加糖苷键与化学试剂接触，从而提高降解速度。利用微波辅助酸法水解浒苔褐藻多糖, 通过改变酸浓度、反应温度和反应时间可以得到分子量为3.31~446.5 ku的褐藻多糖^[10]。利用30% H₂O₂、超声波辅助降解异枝麒麟菜硫酸多糖，相对分子质量可降至5 ku。研究表明，物理辅助化学法降解褐藻多糖硫酸酯具有可行性，但对一般的实验室，这种方法受到一定的限制。

1.3 多糖水解酶法

酶水解是用专一性糖苷酶和非专一性的其它酶的来进行多糖的降解，通过特异开裂多糖中的某一糖苷键来达到降解的目的。在酶水解的过程中无其它反应试剂加入，没有副产物生成，通过添加合适的酶、选择合适的水解条件将能大大促进多糖的水解及后续转化应用。在海藻多糖水解的过程中通常会应用以下几种酶：

1.3.1 琼胶酶

琼胶酶是一类能够降解琼胶多糖的酶的总称，根据降解琼胶多糖的作用方式不同，分为α-琼胶酶(EC3.2.1.158)和β-琼胶酶(EC3.2.1.81)两种^[11]。研究表明琼胶酶(agarase)能够降解琼胶多糖为聚合度2~10的琼胶寡糖(oligosaccharide)，而琼胶寡糖是一种极具开发潜力的功能性低聚糖。目前对琼胶酶研究较为全面，包括酶学性质、酶的结构及催化机制、酶基因等均有一定的研究，但目前对琼胶酶的固定化研究还较少^[12]。

1.3.2 卡拉胶酶

卡拉胶具有非常不均匀的化学结构，这取决于藻类来源和生命阶段。而卡拉胶酶根据卡拉胶的不同结构可大致分为kappa型、iota和lambda型^[13]。相较于物理和化学方法，微生物酶的活性是非常高的，同时其专一性也是比较高的，在对产物进行降解的时候，硫酸根并没有遭受损害，所以可以很好的对卡拉胶进行降解并保持其活性不受损伤。

1.3.3 新琼二糖酶

琼脂糖通常可以被β-琼脂糖酶降解为聚合度4、6、8和10的低聚糖。而新琼二糖酶切割新还原四糖中的中心β-连接和非还原糖附近的β-连接得到新生二糖^[14]。新琼二糖酶的出现使琼脂分解的更加彻底以利于生物应用。

1.3.4 硫酸酯酶

硫酸多糖在生物体内的降解通常是利用一组能够裂解碳水化合物主干上的糖苷键并从碳水化合物上去除硫酸盐基团修饰的酶，称为糖苷水解酶和硫酸酯酶^[8]。特定的糖苷水解酶或多糖裂解酶通过水解糖苷键和β-elimination机制分别与硫酸酯酶协同作用产生中性的单糖和寡糖，然后用于能源消耗。硫酸盐酶的种类可根据序列同源性、结晶结构和作用机理将分为以下几类：

I型硫酸盐酶（甲酰甘氨酸依赖的硫酸盐酶）包括绝大多数已知的硫酸盐酶和目前所有具有生物化学特征的碳水化合物硫酸盐酶。在厌氧细菌中，半胱氨酸和丝氨酸残基可以被另一种厌氧硫酸盐酶修饰。然而，目前的研究机制普遍认为，最后步骤的反应涉及硫酸盐阴离子和甲酰基甘氨酸之间的共价键，和水解生成甲酰基甘氨酸。该反应结果保留了碳的构型，碳中心的手性不受脱硫催化的影响^[10]。

II型硫酸酯酶包括铁(II)α-酮戊二酸盐依赖性的烷基硫酸酯酶，属于加双氧酶总科^[15]。催化的反应过程需要氧分子和作为基质的α-酮戊二酸，这使得硫酸酯基团氧化成醛，同时伴随着α-酮戊二酸盐氧化脱羧成琥珀酸。

III型硫酸酯酶以二价锌或二价锰金属端-β-内酰胺酶为主^[16]。硫酸酯键的裂解通过由位于活性位点的双核金属离子复合物激活的水分子对碳的亲核攻击而发生的，硫酸盐基团的丢失导致碳构型的反转。没有碳水化合物的硫酸盐酶属于II型或III型硫酸盐酶。

另外两组酶代表的是另一种潜在的硫酸酯酶家族。从海洋细菌Pseudoalteromonas carrageenovora中纯化出一种属于酰胺水解酶超家族的硫酸酯酶，其重组表达的酶在合成底物（即甲基二甲基硫酸酯）上具有活性，但它却显示出比天然纯化酶更低的活性^[10]。其家族中的半乳糖-6-硫酸化酶催化水解半乳糖的同时释放出硫酸根。

由此可见，硫酸酯酶基因家族种类繁多，但是在当今基因组大数据分析的背景下，迄今为止只报道了不超过一百种特征酶且所属菌群大部分处在深海。而且由于此酶的生产成本比较高昂，因此目前也未见其在海藻硫酸多糖中的应用，更不用说在转化生物能源上的报道。因此，通过分析其结构，通过基因工程的手段，在研究其酶学性质的基础上，分析其在转化海藻多糖生物利用率的潜力，是提高海洋生物质能转化的重要过程。

3 海藻多糖水解技术在生物能源转化中的应用

海洋类生物质如海藻多糖因其生长速度快，适应能力强，含有较高的碳水化合物含量，少含或不含木质素，培养条件简单，能吸收大量的二氧化碳以减缓温室效应等特点，已经成为下一个具有高效转化生物燃料潜力的生物质原料（图2）。在前期报道中，Wijesinghe等人在2011年将化学降解和生物降解法结合，将海藻多糖水解率提升至95.6%，并将其利用于乙醇生产，产量4.4 g/L

^[13]；Seo等则利用菌株Saccharomyces cerevisiae KL17 借助无酸处理的两步酶解过程，将琼脂糖转化为乙醇^[17]。Wu等第一次报道通过重组琼胶酶(AgaXa)和新琼二糖水解酶(NH852)进行协同糖化作用将琼胶转化为半乳糖，并借助菌株Enterobacter sp. CN1 将水解产物进行发酵转化为生物氢气^[11]。2017年，Bjerre 等人将海藻水解所形成的葡萄糖等单糖产物产物应用于梭菌的生物丁醇发酵，产量达到7.16 g/L^[18]。

由此可见，以海洋生物质为原料，通过水解和发酵转化生物能源，是现阶段实现能源可持续发展的重要途径之一。近年来，许多研究开始通过整合生物处理工艺的方法^[19]，即先将生物质进行预处理，接着在同一反应器内进一步发酵生成目的产物的过程，实现对海藻生物质的能源转化应用，该过程和单纯的化学或者物理处理的方法相比，通过生物酶法的加入或者联用，在较为温和、低污染的条件下，有效的提升了海藻多糖的水解效果，以及目的终产物的产量，也展现了海藻多糖作为生物质应用于生物能源生产的潜力和可能性。

图2 海藻生物质水解产物应用于转化生物能源物质的过程^[10]

总的来说，作为海洋生物质中最丰富的资源之一，海藻多糖的生物质能源转化应用领域仍未得到充分发展，而水解酶介导的藻类生物质水解被认为是一种具有开发可再生原料潜力的生产转化过程。但是目前关于借助水解酶等参与海藻多糖转化生产生物能源物质，特别是生物丁醇的报道还屈指可数。随着基因组大数据技术的日益发展，结合各种基因工程技术手段，将会不断出现更多种类的、可高效水解海藻多糖的蛋白酶类，实现海藻多糖的大规模高值化的可持续利用过程。

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