近红外荧光探针基于结构的设计策略与最新进展

王郑龙 王松立 周湘 *

中国药科大学理学院，江苏省南京 611198

摘要

近红外荧光探针以其优秀的灵敏度和抗干扰性能在生物检测中被广泛应用。近红外荧光探针也成为荧光探针领域的研究热点之一。本文从近红外荧光探针的结构出发，概述了近年来对于近红外荧光探针基于结构的设计策略，以及这些荧光探针的机理及特点。

Abstract:

Near-infrared fluorescent probes are widely used in biological detection due to their excellent sensitivity and anti-interference performance. Near-infrared fluorescent probes have also become one of the research hotspots in the field of fluorescent probes. In this paper, based on the structure of NIR fluorescent probes, the structure-based design strategy of NIR fluorescent probes in recent years, as well as the mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized.

1.前言

荧光染料和荧光团是一类能够被光激发而产生荧光的物质，基于他们而设计的分子探针在生物分析等领域发挥了重要作用。近红外光波段与生物荧光本底值之间存在200nm以上的距离，对干扰信号具有较好的屏蔽作用。这使得利用近红外荧光探针来检测分析生物样品具有显著的优越性。构建对不同样品有高区分度，对微量样品有较低检测限，对生物体无不良作用，生物可耐受的近红外荧光探针是荧光探针研究领域的重要课题。本文主要对近年来近红外荧光探针的设计与应用进展进行概述。

2基于结构的设计策略

2.1基于香豆素结构的设计

香豆素及其衍生物作为天然产物，在植物界中大量存在。香豆素类化合物的内酯结构可以与苯环产生共轭，共轭体系对荧光量子产率有提升作用，体系能量降低可以增大Stokes位移^[1]。通过合理设计，可以控制香豆素的光学性质，这使得这类化合物能够成为优秀荧光母核之一。简单香豆素受自身分子性质的限制，荧光强度和波长不能达到要求，但在香豆素的苯环上引入推电子或电荷密度大的基团，会有效提高分子内电荷密度，从而明显提高荧光强度。香豆素的3-位具有易于衍生和调控波长的特点，因此3-位是香豆素分子修饰常用位点，通过延长分子共轭实现分子合理改造。

Wang Kai等人在7-羟基香豆素的3位引入苯并噻唑结构，通过C-C单键连接，增大原有共轭体系而得到新型近红外荧光分子^[2]。通过甲酰化和随后与NBD-NHNH₂的缩合，进一步得到可有效检测环境中Ni²⁺的荧光探针。该探针可以与Ni²⁺形成螯合物而失去荧光性能，再利用CN^-与Ni²⁺的配位反应，将Ni²⁺从螯合物中解离出来而恢复荧光。Feng Shumin等人通过用2,4-二苯并磺酰磺酰基基团保护氢喹喔啉亚氨基香豆素的亚氨在生理pH条件下，该探针可高度区分H₂S与其他含硫物质，对低浓度的H₂S能有效检测，并能以较大的斯托克斯位移发射荧光。该荧光分子具有低细胞毒性，可用在活细胞和动物中对H₂S成像。Huang Yongfei等人通过异佛尔酮与香豆素的反应，在香豆素3-位引入吸电子长共轭体系，成功设计出对HOCl具有响应快、检测限低特性的近红外比率式荧光探针。通过对细胞进行成像，该探针可以成功识别内源性的ClO^-，对外源性的ClO^-也能做出响应，提示有可能应用于早期临床诊断^[3]。

2.2基于花菁染料结构的设计

花菁染料的典型结构是由奇数个碳原子形成的共轭链和其两端连接的两个含氮杂环构成。两个含氮杂环的氮原子有所不同，其中一个常做成季铵盐而带有正电荷，另一个则是叔胺。两个氮原子可以在分子内产生强烈的诱导效应^[4]。

Wang Guimei等人利用方酸菁染料易聚集的特性，设计了用于ATP荧光成像的近红外超分子组装体^[5]。该探针在监测MCF-7细胞的细胞内ATP水平的应用中显示出了高选择性和优秀的灵敏度。Qu Yi等人将部花菁与二吡啶基苯胺相结合，得到近红外荧光旋转染料^[6]。细胞成像实验显示该分子可以靶向细胞核附近特定区域，或将成为亚细胞水平特定位点可视化的候选分子。Wang Kaiping等人将Schiff碱与花菁染料相连，构建出检测GSH的近红外荧光探针

^[7]。基于Schiff碱基的红移可以高灵敏度和选择性地检测GSH，对于生命科学研究具有重要意义。Wang Yue等人基于七亚甲基花菁荧光团和巯基响应基团构建出稳定的比率型近红外荧光探针^[8]。该荧光探针在离子选择性实验中表现出对Hg²⁺有很高的区分度。

2.3基于氧杂蒽结构的设计

根据氧杂蒽的9-位是否被取代，可以将氧杂蒽类荧光团分为两类：9-位无取代的单纯氧杂蒽结构和9-位被邻苯甲酸取代的罗丹明类结构。根据氧杂蒽3，6-位取代情况不同，又可以分为三种：1.罗丹明结构，氧杂蒽3，6-位被含氮推电子基团取代；2.荧光素结构，氧杂蒽的3，6-位被含氧推电子基团取代；3.其他类型结构，氧杂蒽3，6-位分别被含氧和含氮推电子基团取代。氧杂蒽的3，6-位氨基或羟基是强推电子基团，这使得氧杂蒽分子的电子密度较高，常被用做给电子基团。9-位连接的邻苯甲酸在适当条件下会形成螺环，这一特性常被用来设计成反应位点，以控制荧光的“开关”。

Lin Xin等人利用花菁和香豆素的反应，巧妙地构建出部花菁-氧杂蒽型荧光团^[9]。进一步由该荧光团构建出生物硫醇反应探针，实验表明，该探针可能成为即时检测生物硫醇并实时评估细胞氧化应激的有效工具。Gu Xiaofei等人基于罗丹明衍生物和部花菁构建出对Fe³⁺敏感的新型探针^[10]。经过活细胞和斑马鱼实验，表明该探针没有明显的细胞毒性作用，暗示它可以在生物系统中检测到Fe³⁺。Xia Shuai等人通过将三个不同的BODIPY供体与罗丹明和部花菁素受体缀合，开发了三种荧光探针，用于溶酶体pH值变化的比例测定^[11]。三种探针均已用于确定HeLa细胞中溶酶体的pH变化。Zhao Xiongjie等人通过将作为荧光猝灭基团的2,4-二硝基苯基和H₂S反应部分引入罗丹明近红外荧光团^[12]，可用于检测活细胞中的H₂S。

2.4其他类型

2-甲基色酮的结构与香豆素类似，它的光物理特性与香豆素相当，因此也常被用做近红外荧光团的候选分子。Lv Hehong等人将共轭二氰基亚甲基苯并吡喃结构作为近红外荧光团并以二硫代-二氧杂-单氮杂冠醚部分作为受体构建出新型近红外荧光探针^[13]。该探针成功地在环境水样中对活细胞和斑马鱼幼虫中的Hg²⁺进行荧光成像，并显示出低细胞毒性。

吩噻嗪又称硫氮杂蒽，与氧杂蒽的结构相似。吩噻嗪中的N原子具有较强的给电子特性，同时吩噻嗪的共轭结构具有荧光潜质，因此吩噻嗪也被用于构建ICT型近红外荧光探针，在这些探针中，吩噻嗪部分常以电子供体的作用出现。Dong Yanjing等人开发了一种新型AIE活性荧光探针。该探针的电子受体由罗丹明结构发挥作用，而电子供体是电子密度相对较高的吩噻嗪，该AIE活性荧光探针可用于体内线粒体靶向成像和实时生物成像。

3.结语

近红外荧光探针以其较好的抗背景干扰特性，在生物科学研究和疾病诊断中发挥了重要作用。荧光探针也正向着长波段，高选择性，高灵敏度方向发展。在近红外荧光探针的研究中也存在很多挑战。首先，荧光团种类有待发展。目前研究中常用的荧光团不多，而能构成近红外荧光探针的荧光团很少。较少的荧光团选择范围使得荧光探针的性质改善容易遇到瓶颈，难以开发出优秀的可临床应用的近红外荧光探针。其次，荧光探针的选择性还需提高。例如，Cys与GSH具有相似的结构，如何真正高选择性和高灵敏度地区分它们仍存在挑战。生物体内环境是复杂多变的，而荧光探针在多数情况下对生物具有潜在毒性，因此开发有较轻副作用，生物可耐受的和稳定高效的荧光探针仍具有挑战。

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王郑龙，1994年7月，湖北襄阳人，硕士研究生，主要研究方向为小分子荧光探针分子的设计及合成。周湘，1979年8月，河北泊头人，副教授，主要研究方向为小分子荧光探针分子的设计及合成，邮箱stephanie055@163.com。