海南合瑞制药股份有限公司,海南海口市 570311
[摘要] 目的 建立HPLC法测定依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺、硝基苯。 方法 色谱条件为:安捷伦液相1260;柱温:室温;流动相:流动相A:磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠3g,加水适量使溶解,加三乙胺1ml,加水至1000ml,摇匀,用磷酸调节pH值至4.5);流动相B:乙腈;梯度洗脱;进样量:20μl;流速:1.0ml/min;检测波长:230nm。 结果 本分析方法专属性、灵敏度、准确度均良好。 结论 该方法简便、准确,可用于依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺、硝基苯的检测。
[关键词] HPLC;依达拉奉;基因毒性杂质;联苯胺;硝基苯
依达拉奉是一种新型的脑保护剂,又是自由基清除剂。它主要用于改善急性脑梗塞的患者,所出现的神经症状,改善其日常生活能力和功能障碍。随着基因毒性杂质愈来愈备受关注,为了进一步研究本品可能潜在基因毒性杂质,本文建立了测定依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺、硝基苯的HPLC方法。
1、材料与方法
1.1试剂与仪器
甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
安捷伦液相1260;电子分析天平EX225DZH;pH计PB-10。
1.2方法
1.2.1色谱条件 参考本品的起始物料苯肼的有关物质检测方法:色谱柱:C18色谱柱;流动相:磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠3g,加水适量使溶解,加三乙胺1ml,加水至1000ml,摇匀,用磷酸调节pH值至6.8)-乙腈(75:25);进样量:20μl;流速:1.0ml/min;检测波长:230nm。在此基础上开发了本品的潜在基毒杂质检测方法。
1.2.2供试品溶液及对照品
取本品适量,精密称定,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液,作为供试品溶液;取联苯胺、硝基苯对照品各适量,精密称定,加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含联苯胺与硝基苯各0.25µg的溶液,作为对照品溶液。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
2.1.1 流动相比例的选择
以水相为磷酸盐缓冲液(pH=6.8),有机相为乙腈,按不同比例进行配比作为流动相进行考察,结果如下表。
流动相比例 | 依达拉奉 保留时间/min | 联苯胺 保留时间/min | 硝基苯 保留时间/min | 结果分析 |
80:20 | 9.631 | 19.445 | 42.524 | 联苯胺受未知杂质峰干扰 |
75:25 | 约8 | 约15.5 | 约35 | 联苯胺受未知杂质峰干扰 |
70:30 | 约6 | 约10 | 约34 | 依达拉奉峰拖尾干扰联苯胺测定 |
由结果显示,出峰顺序依次为依达拉奉峰、联苯胺峰、硝基苯峰,联苯胺峰较靠近依达拉奉峰,受依达拉奉拖尾峰干扰。其中,从联苯胺峰、依达拉奉峰保留时间来分析,比例为75:25的配比较佳。
2.1.2 流动相pH值的选择
由于继续调整流动相比例无法获得较理想的分离效果。另参考了本品的苯肼检查项下的分析方法(水相的pH值为4.5),在流动相比例为磷酸盐缓冲液-乙腈(75:25)的配比下,调节磷酸盐缓冲液的pH值进行考察,结果如下表。
流动相的pH值 | 依达拉奉 保留时间/min | 联苯胺 保留时间/min | 硝基苯 保留时间/min | 结果分析 |
5.0 | 约8 | 4.323 | 33.688 | 联苯胺受基线干扰 |
4.5 | 约8 | 3.907 | 36.864 | 联苯胺受甲醇溶剂峰干扰 |
4.0 | 约8 | 2.652 | 36.497 | 联苯胺受溶剂峰干扰 |
由结果显示,联苯胺峰受磷酸盐缓冲液的pH值影响较大,当磷酸盐缓冲液的pH值为4.5时,基线较平,联苯胺与相邻杂质峰的分离度较大。
2.1.3 梯度洗脱程序的优化
由于硝基苯峰保留时间较长,为了缩短分析时间,以磷酸盐缓冲液(pH=4.5)为流动相A,乙腈为流动相B,采用梯度洗脱程序(见表1~3),进行考察,结果见表4。
表1:梯度洗脱程序1
T/min | A% | B% |
0 | 75 | 25 |
5 | 75 | 25 |
12 | 70 | 30 |
30 | 70 | 30 |
31 | 25 | 75 |
45 | 25 | 75 |
表2:梯度洗脱程序2
T/min | A% | B% |
0 | 75 | 25 |
5 | 75 | 25 |
12 | 72 | 28 |
30 | 72 | 28 |
31 | 25 | 75 |
45 | 25 | 75 |
表3:梯度洗脱程序3
T/min | A% | B% |
0 | 75 | 25 |
5 | 75 | 25 |
12 | 69 | 31 |
30 | 69 | 31 |
31 | 25 | 75 |
45 | 25 | 75 |
表4:梯度洗脱程序优化考察结果
洗脱梯度序号 | 依达拉奉 保留时间 | 联苯胺 保留时间 | 硝基苯 保留时间 | 结果分析 |
1 | 约9 | 4.072 | 约23 | 硝基苯峰容易受其他未知杂质峰干扰 |
2 | 约9 | 4.163 | 约24 | 硝基苯峰受其他未知杂质峰干扰 |
3 | 约9 | 4.160 | 22.909 | 联苯胺峰和硝基苯峰均未受干扰 |
由表4结果显示,梯度洗脱程序3较佳。由于联苯胺可能受甲醇溶剂峰干扰,供试品溶液与对照品的制备方法修改为:取本品适量,精密称定,置10ml量瓶中,加乙腈3ml使溶解,并用流动相A稀释至刻度,制成每1ml中约含10mg的溶液,作为供试品溶液。取联苯胺、硝基苯对照品各适量,精密称定,加溶剂[流动相A-乙腈(70:30)]溶解并定量稀释制成每1ml中约含联苯胺0.06µg、硝基苯0.25µg的溶液,作为对照品溶液。代表性图谱见图1~2。
图1:对照品溶液色谱图
图2:50%准确度供试品溶液色谱图
2.1.4 色谱条件的确定
色谱柱:C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);柱温:室温;流动相:流动相A:磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠3g,加水适量使溶解,加三乙胺1ml,加水至1000ml,摇匀,用磷酸调节pH值至4.5);流动相B:乙腈;洗脱梯度如表3所示;进样量:20μl;流速:1.0ml/min;检测波长:230nm。
2.2 分析方法学验证
2.2.1定位试验与空白干扰试验
由试验结果可知:依达拉奉出峰时间为9.131min, 联苯胺出峰时间为4.043min, 硝基苯出峰时间为23.771min;溶剂、苯胺、苯肼、依达拉奉、苯酚均无干扰联苯胺、硝基苯的测定;联苯胺峰、硝基苯峰与相邻杂质峰的分离度均符合要求。
2.2.2 检测限与定量限
由试验结果可知:联苯胺的检测限为0.16ng,定量限为0.32ng,相当于样品浓度的0.81ppm和1.62ppm;硝基苯的检测限为0.63ng,定量限为1.26ng,相当于样品浓度的3.14ppm和6.28ppm。说明该方法的检测灵敏度高,满足使用要求。
2.2.3线性关系与范围
由试验结果可知:联苯胺浓度在8.07ng/ml~96.89ng/ml范围内,线性方程y = 0.0353x +0.0003,相关系数r =0.9996>0.990;硝基苯浓度在31.40ng/ml~376.77ng/ml范围内,线性方程y = 0.0226x +0.2171,相关系数r =0.9994>0.990;联苯胺、硝基苯的峰面积与溶液浓度均呈良好的线性关系。
2.2.4准确度
由试验结果可知:在50%、100%、150%准确度供试品溶液中,联苯胺的平均回收率分别为107.2%、107.6%、102.1%;硝基苯的平均回收率分别为94.0%、91.6%、95.7%,均在要求的80.0%~115.0%范围内。该方法的准确度良好。
2.2.5精密度试验
由试验结果可知:取同一批本品分别进行重复性试验和中间精密度试验,12组分析数据中,联苯胺、硝基苯含量的RSD%均<10,表明精密度良好。
2.2.6 耐用性试验
由试验结果可知:该检测方法的检测波长变化±2nm,流动相A pH值改变±0.05,以及同类型的不同色谱柱的耐用性均良好。
3 结论
本文建立了测定依达拉奉基因毒性杂质的HPLC方法,由方法学验证结果表明,该方法专属性、灵敏度、准确度均良好,可用于依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺与硝基苯的检测。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:374-377.
3