氧化还原氧化还原电位对稻草猪粪协同生物降解的影响

氧化还原氧化还原电位对稻草猪粪协同生物降解的影响

王林平

南昌市国昌环保科技有限公司 ; 江西南昌； 330000

摘要：环境中氧化还原电位(ORP)对微生物的代谢过程有着显著的影响，为探究不同初始ORP对稻草和猪粪混合物生物降解的影响，以前期构建的纤维素降解复合菌系为预处理手段，通过添加不同化学试剂的方式控制初始氧化还原电位为307 mv、221 mv、123 mv、-31 mv、-249 mv，监测了96 h内不同ORP预处理条件下降解液内各项关键指标。结果表明，当控制初始ORP为-31 mv时，降解液内滤纸酶活最高，为2.68 IU/ml；稻草和猪粪混合物失重率最高可达34.2 %。在此ORP条件下整个降解过程中，预处理液中的氨氮和还原糖水平始终高于其他处理组。过高或过低的初试ORP均不利于稻草和猪粪混合物的生物降解。本研究表明在-31 mv的初始ORP条件下，将稻草和猪粪混合物进行生物预处理可显著提高其处理效果，该研究对农业废弃物的高效生物处置奠定了一定的研究基础。

关键词：稻草；猪粪；生物预处理；氧化还原电位

1 前言

生物预处理是从自然界中分离出一系列能够分泌纤维素酶的微生物，经过纯化后加入废弃物中，并辅以一定的工艺条件，使得其中含有的纤维质类物质被酶降解成小分子物质。由于农业废弃物成分复杂，与单一菌株进行的生物预处理方式相比，多种菌株组合而成的复合菌系能够依靠多种微生物之间的协同作用分泌出更加多样性的酶，从而能够将农业废弃物水解得更加彻底。

影响生物预处理的因素有很多，如碳氮比、预处理时间、氧化还原电位(Oxidation-Reduction Potential， ORP)等^[1]，就氧化还原电位来说，微生物体内时刻进行着各种各样的氧化还原反应，氧化还原电位的平衡对微生物维持正常的生命活动有着非常重要的意义，而微生物体内的ORP受环境影响很大，因此，环境中的ORP对预处理效果影响较大。有研究表明，改变环境中的ORP会导致微生物的代谢途径以及代谢产物的变化^[2]，从而使得菌体内NAD⁺和NADH的比例失衡，进而影响酶的分泌，最终导致底物的水解效率低下。然而，目前关于ORP对农业废弃物预处理影响的报道非常罕见。因此，探究出一个合适的初始ORP对纤维质类农业废弃物的预处理具有非常重要的意义。

课题组前期从自然界中经过富集、筛选、组合得到了一组纤维素降解复合菌系，该菌系在55 ℃条件下，能够在40 h内将滤纸完全降解。前期的研究表明该纤维素复合菌系主要由Clostridium、Petrobacter和Defluviitalea等多种厌氧和好氧微生物组成^[3]，环境中的ORP可能会对该复合菌系的降解作用产生显著影响。因此，本研究以农业废弃物稻草和猪粪为原料，以该纤维素降解复合菌系为预处理手段^[4]，探究了不同初始ORP对稻草猪粪协同生物降解的影响。以期为农业废弃物的高效利用奠定一定的研究基础。

2 材料与方法

2.1 试验材料

稻草取自江西农业大学试验田，晒干后粉碎备用；猪粪取自江西农业大学生猪养殖场，保存于4 ℃冰箱。

2.2 试验方法

2.2.1 培养基

纤维素降解菌活化培养基：酵母膏 1 g，蛋白胨 5 g，CaCO₃ 0.9 g，猪粪 1.8 g，滤纸 5 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1 L，pH 7.6，121 ℃灭菌20 min。

2.2.2 复合菌系的活化

将课题组前期筛得的纤维素降解复合菌系^[17]按照10 % (v/v)接种至已灭菌的活化培养基中，置于55 ℃恒温培养箱内静置培养36 h。

2.2.3 稻草猪粪预处理

按照碳氮比为16：1的比例添加总质量为6 g的稻草和猪粪，按照6%的料水比添加5 g/L的NaCl溶液，按照表1的调控方式通过添加不同的试剂，从而使得初始ORP分别为307 mv、221 mv、123 mv、-31 mv、-249 mv，调节pH至7.6，接种10 %（v/v）活化好的纤维素降解复合菌系，置于55 ℃恒温培养箱内静置培养96 h，测定发酵液的pH、关键酶酶活、氨氮、还原糖、失重率等参数。

表1 不同的ORP水平及调节方式

Table1 Different ORP levels and control methods

ORP水平	调节方式
307 mv	添加10 ml 12.5 g/L K3[Fe(CN)6溶液]
221 mv	添加10 ml 12.5% H2O2溶液
123 mv (对照组)	添加10 ml 蒸馏水
-31 mv	添加10 ml 12.5 g/L Na2SO3溶液
-249 mv	添加10 ml 10 g/L DTT溶液

2.3 分析方法

将发酵液在8000 rpm条件下离心10 min后，取上清液用于测定滤纸酶活和CMC酶活^[17]；使用pH计测定发酵液pH；氨氮的测定采用靛酚蓝反应法^[5]；使用DNS法测定还原糖的含量^[6]；ORP使用氧化还原电位仪测定；使用盐酸硝酸混合液洗涤法测定失重率^[7]，使用范式洗涤法测定纤维素、半纤维素和木质素的含量^[20]。

2.4 数据处理

使用Origin 9.1对实验数据进行处理。

3 结果与讨论

3.1 底物成分分析

由表2可知，稻草中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等纤维质，这些纤维质内部具有极其丰富的氢键网络结构，可以有效阻止发酵过程中微生物与底物的结合从而导致利用率下降，因此需要在发酵前对其进行预处理。此外，由表2可知，农业废弃物稻草的含碳量高达45.64 %，而氮含量仅为1.34 %，而猪粪中含有39.31 %的碳，氮含量高达4.52 %。单一地使用某种材料会导致碳氮比不平衡的问题，研究显示，在低碳氮比的环境中，碳源不足会导致微生物的生长抑制并且微生物降解底物会产生大量的氨氮物质，进而在系统中积累过量的氨氮并抑制底物的降解^[8]；而在高碳氮比的环境中，微生物降解底物会产生大量的有机酸，从而导致系统酸化，使反应难以进行。因此将稻草和猪粪混合进行生物预处理，能够较好的解决因碳氮比不平衡导致的反应抑制现象。

表2 试验材料的基本性质

Table 2 Basic properties of experimental materials

3.2 不同初始ORP对预处理液内pH的影响

由图1可知，不同初始ORP条件下各处理组降解液内pH的变化均呈现出先下降后上升的趋势，其原因可能是体系中的微生物菌群通过分解纤维素等物质产生了大量的有机酸导致pH在降解前0-60 h呈现下降的趋势，进一步延长处理时间，体系内的微生物因自溶会产生氨氮物质，并且微生物的生长繁殖亦会导致有机酸被消耗，最终表现为pH的上升，这表明稻草和猪粪经纤维素降解复合菌系预处理时具有较好的pH自我调节能力，可有效防止系统酸化。从图1中还能发现当初始ORP为-31 mv时，其pH下降的最低点比其他处理更低，这表明在此初始ORP条件下进行生物预处理可得到更高的有机酸产量。此外，在不同的初始ORP条件下，稻草和猪粪的生物预处理均可正常进行，这是由于纤维素降解复合菌系里面含有多种不同的好氧、厌氧以及兼性厌氧菌，这些微生物在体系内互利共生，共同促进稻草和猪粪内的纤维类物质降解^[9]。

图1 不同初始ORP条件下pH的变化

Fig.1 Changes of pH value under different initial ORP condition

3.3 不同初始ORP对预处理液内关键酶酶活的影响

微生物产生的各类酶在水解阶段中起着至关重要的作用，有研究表明环境ORP的改变会影响胞内NADH和NAD⁺的比例进而影响微生物分泌酶的能力^[10]。通常，微生物对纤维素类物质的降解能力用CMC酶活来表示，而对总木质素类物质的降解能力则用滤纸酶活表示^[11]。由图2中可知，不同初始ORP对预处理液中的酶活影响显著，当初始ORP为-31 mv时，预处理液中的滤纸酶活最高，为2.68 IU/ml，说明在微厌氧条件下，复合菌系能分泌大量的酶以促进纤维素的降解；而在-31 mv的初始ORP下，预处理液中的CMC酶活也高达4.68 IU/ml。此外，由图2可知在各处理组(221 mv、307 mv、-31 mv、-249 mv)预处理液中的CMC酶活均低于对照组(123 mv)，这可能是纤维素降解复合菌系中含有大量的好氧、厌氧和兼性厌氧微生物，在自然条件下，菌系中的好氧和兼性厌氧微生物可为厌氧微生物提供大量的营养物质以供其分泌酶系，而当改变其初始ORP时，营造的更加严格的厌氧或好氧的环境不利于复合菌系中各种微生物的共生作用，使得分泌的酶系减少，导致预处理液中的酶活下降。总的来看，虽然在-31 mv的初始ORP条件下CMC酶活略有下降，但从图3中的稻草失重率来看，-31 mv处理组中的滤纸酶活更高，因而对纤维素具有更优秀降解能力。

图2 不同初始ORP条件下关键酶酶活的变化

Fig.2 Changes of key enzyme activity under different initial ORP condition

3.3 不同初始ORP对预处理液内稻草失重率的影响

不同初始ORP条件下的稻草失重率如图3所示，各处理组的稻草失重率均随处理时间的增加而上升，且各处理组间的差距不大。从图3可以看到，在预处理的96 h中，对照组(131 mv)的稻草失重率最低，为29.1 %，而在-31 mv的初始ORP条件下，稻草失重率最高，达34.2 %，比对照组提高了17.53 %。其原因可能是在-31 mv的初始ORP下，复合菌系中的各种微生物相互协作，产生了大量酶，这些酶共同作用使得稻草的中纤维质被水解成小分子物质，这些小分子物质能够缩短农业废弃物后续利用环节的时间，使农业废弃物更加高效地被利用。上述结果表明，-31 mv的初始ORP是稻草和猪粪生物预处理的最佳初始ORP。

图3 不同初始ORP条件下稻草失重率的变化

Fig.3 Changes of straw weight loss rate under different initial ORP condition

3.4 不同初始ORP对预处理液内代谢产物变化的影响

不同初始ORP条件下预处理液内的氨氮浓度变化情况如图4(a)所示，各处理组中氨氮含量的变化趋势一致，均为先上升后下降，其原因可能是在预处理的0-24 h内，稻草和猪粪中的蛋白质等物质被分解，导致氨氮含量迅速上升，24 h之后，预处理液中的微生物可能由于度过延滞期而大量繁殖，其消耗的氨氮速率大于微生物分解蛋白质等物质产生的氨氮速率，因此氨氮浓度呈现下降的趋势。此外，从图4(a)中还能发现，在初始ORP为-31 mv时，氨氮的最高浓度高于其他处理组，为549 mg/L。由图4(b)可知，各处理组中还原糖含量均在12 h迅速上升，其中初始ORP为-31 mv条件下的还原糖含量最高，达到205 mg/L，进一步延长预处理时间，各处理组内还原糖含量呈小幅度波动，但-31 mv处理组的还原糖含量在整个预处理过程中始终高于其他处理组。这可能是由于环境中ORP的变化，影响了微生物体内的代谢途径，使得在初始ORP为-31 mv时的水解效率有所提高^[12]，从而能够降解更多的底物产生更多的还原糖。上述结果表明，-31 mv的初始ORP有利于纤维素降解复合菌系对稻草和猪粪中纤维质物质的降解，有效提高预处理效果。

图4 不同初始ORP条件下降解液内代谢产物的变化

Fig.4 Changes of degradation of metabolites in solution under different initial ORP condition

4结论

本研究以农业废弃物稻草和猪粪为底物，以纤维素降解复合菌系对其进行生物预处理，探讨了不同初始ORP对预处理效果的影响。结果表明，在初始ORP为-31 mv时，经过96 h的预处理，滤纸酶活和CMC酶活最高可达2.68和4.68 IU/ml，稻草失重率可达34.2 %，比对照组提高了17.53 %。此外，预处理液中的氨氮和还原糖含量均比其他处理组高。表明-31 mv的初始ORP条件下，将稻草和猪粪使用纤维素降解复合菌系进行协同生物降解具有更好的应用价值，为农业废弃物的开发利用奠定良好的基础。

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