整合素 β1促进 GIT1表达而影响软骨细胞增殖凋亡的研究

整合素 β1促进 GIT1表达而影响软骨细胞增殖凋亡的研究

张龙强 赵光宗 苑广科 方军 尹华山

山东省潍坊市益都中心医院 262500

摘要：目的 因此本研究通过建立骨关节炎模型，主要探讨整合素pI和GIT 1对软骨细胞的影响，及二者之间的调控关系。以便对临床上骨性关节炎的治疗起指导作用。 方法本次研究，我们采用约一周龄的年乳大鼠20只，雌雄不限。分别采用定量PCR和Western Blotting检测对照组、pcDNA3.1空载体转染组、pcDNA3.1-GIT 1过表达组、pcDNA3 . I -integrin-p1过表达组、integrin-p 1 siRNA组和NC siRNA组中，integrin-p1和GIT1的mRNA和蛋白质的表达水平，来判断integrin-p1和GIT1之间的调控关系。结论 在体外骨关节炎关节软骨细胞模型中发现，integrin-pl和GIT1均能促进软骨细胞的增殖，并抑制其凋亡发生。integrin-印的过表达可以提高GIT1的表达，反过来，GITI的高表达对integrin-pI没有影响，说明integrin-p1可以调控GIT1的表达，GTI1可能是位于integrin-pI下游的一个关键分子。

关键词:骨关节炎;关节软骨细胞;整合素阳;GITI;细胞增殖与凋亡

整合素是由一个α亚基和一个β亚基以非共价键形式组合而成的单次跨膜的异二聚体,属于粘附分子受体超家族,能介导细胞与细胞外基质之间的双向信号转导。在个体发育、凝血以及细胞粘附、迁移、增殖、细胞存活和血管再生的生物学过程中发挥重要作用。整合素β1即CD29分子表达广泛,能与几乎所有的整合素α亚基组成异二聚体。研究表明整合素β1亚基参与许多细胞功能,如肿瘤的血管新生和生长、粘附、迁移以及增殖等。而且整合素β1在Hp感染胃上皮细胞过程中发挥重要作用,在CagL、CagI以及其他蛋白的辅助下,经由Hp的Ⅳ型分泌系统,介导Hp效应蛋白CagA易位到宿主细胞,继而引起细胞的形态功能改变。

1 材料

1.1 仪器

STERI-CYCLE二氧化碳培养箱和Sorvall ST 16R高速冷冻离心机购于美国Thermo Fisher公司;3131厌氧培养箱购于美国Thermo Scientific公司;FACSAriaⅡ型流式细胞仪购于美国BD公司;Bio-Rad iCycler iQ5和Bio-Rad 680全自动酶标仪购于美国Bio-Rad公司。

1.2 试剂

GES-1细胞购于无锡博慧斯生物医药科技有限公司;Anti-Human CD29(Integrin beta 1)单克隆抗体购于美国eBioscience公司;ATCC 26695国际标准菌株本室保存;ITGβ1siRNA和Lipofectmine2000Reagent为美国Invitrogen公司产品;PrimeScriptTM RT reagent kit,gDNA Eraser,ITGβ1引物,SYBRⅡPremix Ex TaqⅡ,内参基因GADPH引物为日本TakaRa公司产品;TRIzol Reagent购于美国ambion公司产品;凯基凋亡检测试剂盒购于凯基生物公司;Cell Counting Kit(CCK-8)试剂盒购于日本DOJINDO公司。

2 方法

2.1 Hp与GES-1共培养及整合素β1表达的检测

接种上皮细胞GES-1至细胞培养板,使细胞长至约50%。收集新鲜的Hp ATCC 26695,用无菌PBS缓冲液重悬,以2 000r/min(离心半径6.5cm)离心5min,弃上清,PBS洗2次,细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬,通过检测A600值调整细菌浓度为109/ml,以细菌∶细胞为200∶1的比例共培养。共培养不同时间后弃培养基,PBS洗3次,0.25%胰酶消化3min;加1ml PBS收集细胞,1 000r/min(离心半径6.5cm)离心5min,弃上清,加500μl PBS,洗涤2次,细胞重悬于50μl PBS中;加2μl整合素β1单克隆抗体混匀,避光4℃孵育,每5min轻轻震荡,30min后加500μl PBS,1 000r/min(离心半径6.5cm)离心5min,弃上清,洗去未结合的抗体;加入500μl PBS重悬细胞,流式细胞仪检测细胞整合素β1的表达。

2.2 siRNA转染GES-1细胞

接种上皮细胞GES-1至细胞培养板,使细胞长至约50%。用无血清培养基Opti-MEM分别稀释Lipofectmine 2000Reagent和siRNA至推荐浓度,将稀释后的转染试剂与siRNA混合,轻轻混匀,室温孵育5min。生长状态良好的细胞用PBS洗2~3次,将脂质体-siRNA复合物加入到培养板中,空白对照加相同体积的Opti-MEM培养基。4h后弃去此复合物,加入相应体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基,流式细胞仪检测蛋白水平干扰效率。

(1)乳大鼠用硫喷妥钠进行麻醉，使其仰卧于手术台上;

(2)取四肢关节的内侧切口，检查关节腔无原发病变后，将内侧的前后交叉大韧带、副韧带和半月板切断，然后逐层进行切口缝合;

(3)为了预防感染，手术后3天内每天肌内注青霉素20 u1;术后每天驱赶乳大鼠来回走动约0.5小时左右。喂养20天;

(4)取已经建模好的乳大鼠，窒息处死后，用酒精消毒，在超净工作台(无菌条件下)中切取大鼠四肢关节，将肌肉和关节囊等关节周围的组织进行分离，将没有发生骨化的软骨组织切取保留，放入无菌PBS液的无菌玻璃皿内。用眼科剪进行剪碎(越细越好。

3统计学分析

实验至少独立重复三次，所得数据采用均数士标准差(M士SD)表示。组间比较采用单因素方差分析或Mann-Whitney U检验，多组间比较采用SNK-q检验或Kruskal-Wallis H检验进行，P<0.05为有统计学差异。统计学分析均采用SPSS 19.0软件(SPSS公司，USA)。

4结果

按照实验方法所述，构建乳鼠骨关节炎模型，然后提取软骨细胞组织，进行组织的破碎，用trizol法提取总1ZNA，逆转录得cDNA模板，接着用设计好的integrin-p1, GIT1引物分别扩增编码区并进行克隆，采用siRNA沉默integrin印法、荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析integrin pI和GITI在软骨细胞中的作用及二者之间的关系。每个基因每个样本都进行三次技术重复。

5讨论

细胞极性的产生和维持是通过胞内细胞器不均匀分布, 以及细胞骨架动态改变和膜转运共同实现的, 是多种蛋白复合物共同参与的一系列协同作用的结果。细胞极性使细胞≥2个部位具有结构和功能上的差异。在上皮细胞中, 这种空间上的差异被定义为顶点端和基膜端。细胞与胞外基质相互作用是极性形成的基础, 而细胞外基质信号的传导需要通过整合素来完成。越来越多的人认识到整合素在上皮细胞极性的建立中发挥重要作用。正常腺管细胞的极性, 使顶点分泌面位于管腔侧, 而基底膜面则位于基膜侧, 这一极性膜的不对称分布可以确保细胞分泌的乳汁进入到管腔中, 而在癌中, 这种细胞极性丧失, IMPC中, 则发生“极性倒转”。IMPC高侵袭和高转移生物学行为的产生是否与这种“极性倒转”的组织学结构有关是我们研究的重点课题。整合素β1广泛表达于上皮细胞, 在上皮细胞极性的建立以及上皮细胞表面极性倒转中起重要作用。整合素连接激酶 (integrin-linked kinase, ILK) 通路是整合素发挥作用的一个重要信号通路, 整合素-ILK的黏附可以促使其与胞内微管的阳性末端连接, 调节并且稳定微管, 进而可以在多重水平上促进细胞极性的建立。而整合素与ILK的连接则需要Kindlin-2的调节。整合素β1与Kindlin-2的C-末端相结合, 同时, Kindlin-2的N-末端则可与ILK相连接, 从而形成一个整合素-ILK-微管的网络, 共同调节细胞极性。

用Hulth法建立骨关节炎模型，进行关节软骨细胞的分离获取，一步消化法(II型胶原酶)处理骨关节炎大鼠的关节软骨细胞，分离软骨细胞后进行传代培养。采用Trizol法提取关节软骨细胞总RNA，并采用PCR技术扩增integrin-X31和GIT1编码区，用Kpn I, EcoR I双酶切克隆到pcDNA3.1载体上。然后通过RNAi实验抑制integrin-(31的表达。 取第一代的骨关节炎软骨细胞进一步培养，分别采用定量PCR和WesternBlotting检测对照组、pcDNA3.1空载体转染组、pcDNA3.1-GIT 1过表达载体转染组、pcDNA3.1-integrin-盯过表达载体转染组、integrin-p1 siRNA转染组和NCsiRNA转染组中II型胶原蛋白和蛋白多糖的表达。分别采用BrdU法和TUNEL-DAPI检测软骨细胞的增殖和凋亡现象。研究结果 荧光定量PCR实验表明，转染rote幼n p1-siRNA后，敲除integrin p1的表达时，GIT1 mRNA的表达水平相应下降，而过表达integrin p1时，GIT1 mRNA的表达水平显著上调，与对照组进行比较，具有统计学差异意义(P<0.05 );然而提高GIT1的表达后，integrin印mRNA的表达水平不受影响。采用蛋白免疫印迹法检测后，蛋白表达水平和基因表达水平相似。敲除integrin印后，GITI的蛋白表达水平随之降低，提高integrin印的表达时一，GIT1的蛋白表达水平上调显著，与对照组进行比较，具有统计学差异意义(P<0.05 )。而GITI过表达时，integrin p1蛋白水平不会受到干扰。

综上所述，integrin-困对调节软骨细胞的增殖、凋亡和分化有重要作用。更为重要的是，integrin-娜通过提高GIT1的表达来促进软骨细胞的增殖，抑制软骨细胞的凋亡。GIT 1作为integrin-印下游的一个分子，对软骨细胞的增殖、凋亡和分化也有同样的作用。然而，integrin-印调控软骨细胞的增殖、凋亡和分化的机制尚未清楚，还待进一步的研究探讨。

参考文献

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项目编号： wfwsjk_2019_095