甲型H1N1流感病毒诱导肺泡上皮细胞低氧诱导因子-1α核转位的机制

(整期优先)网络出版时间:2020-08-10
/ 1
摘要目的探讨在肺泡上皮细胞模型中甲型H1N1流感病毒(H1N1病毒)诱导低氧诱导因子-1α(HIF-1α)核转位的分子机制。方法体外培养人肺腺癌上皮细胞(A549细胞),选取对数生长期细胞用于实验。①实验1:采用感染复数(MOI)1.0的H1N1病毒感染细胞24 h,建立H1N1病毒感染的A549细胞模型(H1N1病毒感染组);并设立空白对照组。采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞中核转运受体蛋白(Importin 4、Importin 7)表达,探讨HIF-1α核转位是否依赖Importin 4、Importin 7。②实验2:采用不同MOI(0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0)的H1N1病毒感染细胞24 h;采用MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞0、3、6、12、18、24、36 h。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中胞裂蛋白9基因变异剪接体1(SEPT9_i1)mRNA表达,探讨不同MOI和感染时间对SEPT9_i1表达的影响。③实验3:采用小干扰RNA(siRNA)转染细胞24 h抑制SEPT9_i1,建立沉默SEPT9_i1的A549细胞模型(siRNA-SEPT9_i1组);并设立空白对照组和空白载体对照组(siControl组)。3组细胞转染24 h后均给予MOI 1.0的H1N1病毒感染24 h,采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞中SEPT9_i1 mRNA表达,以探讨siRNA对SEPT9_i1的干扰效率。④实验4:将细胞分为siControl组和siRNA-SEPT9_i1组,两组细胞转染方法同实验3。转染24 h后,两组均以MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞,于24 h采用免疫荧光法观察细胞中HIF-1α核内外分布情况;于6、12、24、36、48 h采用实时荧光定量RT-PCR检测病毒M基因表达,以明确SEPT9_i1对HIF-1α核转位和病毒复制的影响。⑤实验5:将细胞分为空白对照组(完全培养基)、SP600125组〔100 μmol/L的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路抑制剂SP600125处理细胞2 h〕、H1N1病毒感染组(MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞24 h)和H1N1病毒+ SP600125组(100 μmol/L的SP600125预处理2 h后,再加入MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞24 h)。采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达,探讨JNK信号通路对SEPT9_i1表达及病毒复制的影响。结果①实验1:与空白对照组相比,H1N1病毒感染组A549细胞中Importin 4和Importin 7蛋白表达差异均无统计学意义〔Importin 4蛋白(Importin 4/GAPDH):1.08±0.03比1.05±0.03,Importin 7蛋白(Importin 7/GAPDH):0.87±0.11比0.78±0.03,均P>0.05〕。说明H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位可能不依赖Importin 4和Importin 7。②实验2:A549细胞中SEPT9_i1 mRNA表达随H1N1病毒MOI增加及感染时间延长呈升高趋势,分别于MOI 2.0和感染18 h达峰值,与MOI为0或感染0 h比较差异均有统计学意义(2-ΔΔCT:MOI 2.0为1.39±0.05比1.00±0.00,18 h为1.47±0.04比1.00±0.00,均P<0.01)。说明H1N1病毒感染A549细胞中SEPT9_i1表达与病毒MOI及感染时间相关。③实验3:与空白对照组比较,siRNA-SEPT9_i1组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA表达明显下调(2-ΔΔCT:0.38±0.11比1.00±0.00,P<0.01),而siControl组与空白对照组比较差异无统计学意义(2-ΔΔCT:1.03±0.16比1.00±0.00,P>0.05)。说明沉默SEPT9_i1可抑制H1N1病毒感染A549细胞中SEPT9_i1表达。④实验4:siRNA-SEPT9_i1组H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位较siControl组明显减少。siControl组感染H1N1病毒后细胞中病毒M基因表达逐渐升高,48 h达峰值;siRNA-SEPT9_i1组A549细胞中病毒M基因表达明显下调,48 h与siControl组比较差异有统计学意义(2-ΔΔCT:3.47±0.66比8.17±0.38,P<0.05)。说明沉默SEPT9_i1后可以抑制H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位和病毒复制。⑤实验5:H1N1病毒感染组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达较空白对照组明显升高;而H1N1病毒+ SP600125组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达均明显低于H1N1病毒感染组(2-ΔΔCT:SEPT9_i1 mRNA为0.12±0.10比1.53±0.14,病毒M基因为2.13±0.10比4.66±0.14,均P<0.05);SP600125组上述指标与空白对照组比较差异均无统计学意义。说明H1N1病毒感染A549细胞中JNK信号通路可以调控SEPT9_i1的表达,而抑制JNK信号通路可以下调SEPT9_i1的表达及抑制病毒复制。结论H1N1病毒通过激活JNK信号通路调控SEPT9_i1的表达,从而提高HIF-1α转运效率以及促进病毒复制。