黄芪甲苷对铅暴露小鼠海马组织中 Nrf2和 HO-1mRNA表达的影响

黄芪甲苷对铅暴露小鼠海马组织中 Nrf2和 HO-1mRNA表达的影响

潘思文 徐天娇 刘雷 邹宇 于春磊

齐齐哈尔医学院 黑龙江省齐齐哈尔市 161006

摘要： 目的 研究黄芪甲苷对铅暴露后小鼠海马组织中核因子红细胞2相关因子(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA表达的影响。方法 运用醋酸铅通过自由饮水的方式构建铅暴露小鼠动物模型，给予黄芪甲苷进行药物干预。运用RT-PCR技术检测Nrf2、HO-1 mRNA表达。结果 给药组与模型组相比，小鼠海马组织中Nrf2、HO-1 mRNA的表达均显著上升。结论 黄芪甲苷通过上调Nrf2和HO-1mRNA表达对铅暴露后小鼠神经发育毒性可能产生抑制作用。

关键词：黄芪甲苷；铅毒性；神经发育毒性；Nrf2信号通路

基金项目：齐齐哈尔市科学技术计划项目任务（SFGG-201915）

[通讯作者]*于春磊，tel：13766577635， E-mail：328828803@qq.com

神经系统发育是一个极其复杂且严密的过程，发育中的神经系统也是对神经毒物的高度敏感时期，任何外在因素的干扰都有可能对神经系统造成不可逆的损伤，引起一系列神经发育障碍。铅对脑发育的毒性作用一直是学者关注的焦点，铅能够损害神经系统的多种功能^[1]。黄芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是中药黄芪的主要活性单体，具有免疫调节、抗炎、抗凋亡、神经保护等作用。核因子红细胞2相关因子（Nrf2）是细胞氧化应激反应中的关键因子，是细胞抗氧化还原的中枢调节者，在细胞的防御保护中发挥重要作用。越来越多的证据提示氧化应激与铅诱导的神经发育毒性密切相关^[2]，本研究初步探讨黄芪甲苷对铅暴露后小鼠神经发育毒性的抑制作用，为研究和开发新一类高效、低毒、副作用小的中药新药提供新思路。

1材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 健康清洁级C57BL/6小鼠（雌性小鼠60只和雄性小鼠30只），购自南京大学-南京生物医药研究院，体重18-20g，动物许可证号SCXK（苏）2015-0001。

1.1.2 药物 黄芪甲苷（纯度98%，南京晶珠生物科技有限公司），醋酸铅（PbAc，分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司）。

1.1.3 主要试剂与仪器

TRIzol^®Reagent（ambion公司），SYBR^®Premix Ex Taq™试剂盒和PrimeScript™ RT Reagent kit（TaKaRa宝生物工程大连有限公司）；核因子红细胞2相关因子（Nrf2）：5′-CCC AGC ACA TCC AGA CAG AC-3′， 5-TAT CCA GGG CAA GCG ACT C-3′；血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1, HO-1）：F5’- CAC GCA TAT ACCCGC TAC CT -3’，R5’- CCA GAG TGT TCA TTC GAG CA -3’；β-actin：R5’- AGCCAT GTA CGT AGC CAT CC -3’，R5’- CTC TCA GCT GTG GTG GTG AA -3’（均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。

1.2 实验分组及给药方法

C57BL/6小鼠在SPF级标准动物房适应性饲养1周后，雌雄2:1合笼，定为受孕0天，随机分为空白对照组、醋酸铅模型组、黄芪甲苷（高、中、低剂量）组，浓度分别为：200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg。每组雌鼠6只，雄鼠3只。空白对照组饮用无铅去离子水，醋酸铅模型组及黄芪甲苷各剂量组饮用250mg/L的醋酸铅溶液（使用去离子水配制），受孕第7天起，黄芪甲苷各剂量组每天灌胃给药一次，连续给药7天。

1.3 RT-PCR技术检测Nrf2、HO-1 mRNA表达。

组织低温充分匀浆，使用Trizol提取总RNA。使用一部分RNA进行定量，以及琼脂糖电泳鉴定RNA纯度和完整性。使用总RNA 2.5μl进行逆转录反应，合成cDNA，取2.5μl cDNA在25μl反应体系中进行PCR扩增。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0统计学软件，数据采用“均数±标准差（x̅±s）”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 黄芪甲苷对神经发育毒性作用中Nrf2、HO-1 mRNA表达的影响。

结果如图所示，模型组与空白对照组比较，Nrf2和HO-1 mRNA的表达量均有所上升，差异有统计学意义（^▲p＜0.05）；给药组与模型组比较，Nrf2和HO-1 mRNA的表达量显著升高，差异有统计学意义（*p＜0.01）。

黄芪甲苷对神经发育毒性作用中Nrf2、HO-1 mRNA表达的影响

3 讨论

铅（lead，Pb）是一种广泛存在于环境中且具有神经毒性的重金属，其在环境中可长期蓄积且难以降解，因而近年来重金属铅的环境风险隐患依然突出^[3、4]。

近年来研究显示，Nrf2信号通路可抵抗内外界氧化和化学物质等刺激导致的氧化应激反应，在机体应对各种外来损伤的防御中起着非常重要的作用。因此，此信号通路被认为是机体内最重要的内源性抗氧化信号通路。Nrf2是调节编码抗氧化基因的细胞保护因子，当受到活性氧簇的刺激时，Nrf2信号通路被激活，Nrf2被磷酸化而活化，活化后的Nrf2进入到细胞核中，与相应蛋白结合并激活下游靶基因II期酶或抗氧化酶，如血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)的表达，从而发挥抗氧化损伤作用。

本研究结果显示，给药组与模型组相比，小鼠海马组织中Nrf2、HO-1 mRNA的表达均显著上升。基于此，可能减轻了小鼠海马组织中氧化应激反应，从而起到防止神经系统进一步损伤的作用。初步探讨黄芪甲苷抑制铅暴露后神经发育毒性的作用机制，为寻找新的治疗靶点提供新的思路。

参考文献：

[1] 周飞, 常艳, 林海霞. 神经发育毒性初筛实验方法的研究现状[J]. 国外医学(卫生学分册), 2009, 05: 311-316.

[2] A.C. Lopes, T.S. Peixe, A.E. Mesas, M.M. Paoliello, Lead exposure and oxidative

stress: a systematic review, Rev. Environ. Contam. Toxicol. 2016, 236: 193–238.

[3] T. Dignam, R. B. Kaufmann, L. LeStourgeon, et al. Control of Lead Sources in the United States, 1970-2017: Public Health Progress and Current Challenges to Eliminating Lead Exposure[J]. J. Public Health Manag. Pract., 2019, 25 Suppl 1, Lead Poisoning Prevention: S13-S22.

[4] D. O'Connor, D. Hou, J. Ye, et al. Lead-based paint remains a major public health concern: A critical review of global production, trade, use, exposure, health risk, and implications[J]. Environ. Int., 2018, 121(Pt 1): 85-101.