幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞分泌 IL-1β和 IL-18的研究

幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞分泌 IL-1β和 IL-18的研究

1叶翠莲 许鈜皓

重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆， 400054

［摘 要］ 目的: 研究幽门螺杆菌的感染对胃上皮细胞激活炎症因子的影响。方法: 建立幽门螺杆菌感染AGS的细胞模型，在感染后的不同时间收集细胞及上清，用ELISA检测其中的IL-1β和IL-18。结果: 幽门螺杆菌诱导AGS细胞产生IL-1β、IL-18，并与其作用时间、剂量呈正相关。结论: 幽门螺杆菌激活胃上皮细胞分泌IL-1β和IL-18，提示其可能与机体免疫防御及致病相关。

［关键词］ 幽门螺杆菌; AGS; IL-1β; IL-18

Research on Helicobacter pylori induces AGS cells to secrete IL-1β and IL-18

Cuilian Ye, Honghao Xu

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing, 400054)

[Abstract] Objective: To study the effect of Helicobacter pylori infection on inflammatory factors activated by gastric epithelial cells. Methods: A cell model of Helicobacter pylori infection with AGS was established. Cells and supernatant were collected at different times after infection, and IL-1β and IL-18 were detected by ELISA. Results: Helicobacter pylori induced AGS cells to produce IL-1β and IL-18, which was positively correlated with the time and dose of action. Conclusion: Helicobacter pylori activates gastric epithelial cells to secrete IL-1β and IL-18, suggesting that it may be related to the body's immune defense and pathogenicity.

[Key words] Helicobacter pylori; AGS; IL-1β; IL-18

幽门螺杆菌 (H.pylori)一种常见人类致病菌，与慢性浅表性胃炎、活动性胃炎的发生密切相关，并与萎缩性胃炎、肠上皮化生、胃癌有密切相联^［1］。幽门螺杆菌感染可引起机体较强烈的固有免疫和适应性免疫应答，但这些免疫应答并不能完全有效的清除幽门螺杆菌，反而由于持续感染导致胃黏膜免疫病理损伤，并分泌多种细胞因子和趋化因子，这些因子的可变调控决定了免疫反应的本质、强度及其致癌的风险性，是细菌感染与癌前病变的重要因素。宿主抵抗感染的机制涉及到固有免疫系统和获得性免疫系统中复杂的免疫反应，固有免疫系统作为机体的第一道保护屏障，起到监控外源性和内源性微生物感染或组织损伤的作用。现有研究认为幽门螺杆菌与胃黏膜炎症有较大相关性，有报道多种细胞因子介导相关的炎症反应^［2］，然而关于其产生的机制尚不明确。本研究建立AGS细胞与幽门螺杆菌为共培养模型，探讨幽门螺杆菌是否激活炎症小体诱导胃上皮细胞产生IL-1β和IL-18，为深刻认识和理解幽门螺杆菌感染，胃炎发病机制探索提供一些实验基础与理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料 幽门螺杆菌26695株为本实验室保存; AGS细胞购于上海中科院细胞库; F12K培养基、胰酶购于Hyclone公司; 胎牛血清购于GIBCO公司；革兰氏染色液试剂盒购于重庆庞通医疗器械有限公司；幽门螺杆菌培养基购于青岛海博生物技术有限公司；琼脂粉购于成都市科龙化工试剂厂；胃幽门螺杆菌检测试剂盒（脲酶法）购于三明市贝真生物科技有限公司；选择性抗生素（含萘啶酮酸、TMP、万古霉素、两性霉素）购于青岛海博生物公司; Nisin购于兰州生物制品所；脱纤维羊血购于自广州蕊特生物科技有限公司;人IL-1βELISA试剂盒购于上海逸峰生物科技公司，人IL-18 ELISA试剂盒购于上海生工公司。

1. 2 方法

1.2.1 幽门螺杆菌的培养、鉴定与收集：将胃粘膜样品放入1ml无菌生理盐水，剪碎后混匀震荡，取100μL混合液到幽门螺杆菌血琼脂培养板中，用接种环划线后放入厌氧培养罐（85% N

₂, 10% CO₂, 5% O₂）内，在培养盒的角落固定处加入约一半的蒸馏水，放入微需氧袋，37℃培养3-5天。对分离所得的菌株进行菌落形态学观察、革兰氏染色涂片镜检、氧化酶试验、尿素酶等试验、触酶试验，PCR扩增鉴定。用无菌的0.01mmol/L PBS（PH7.2）收集幽门螺杆菌，使用核酸蛋白仪测菌液浓度，在实验前将其调整至1×10⁹ CFU/mL备用。

1.2.2 AGS细胞培养：将取出细胞悬液的冻存管迅速放在37℃水浴中轻轻摇晃解冻，然后加入4mL培养基混合均匀。1000RPM离心4分钟后弃上清，再加1-2mL培养基后轻轻抽吸均匀。将所得细胞悬液加入培养瓶中培养过夜，37℃恒温，5%CO₂，湿度为70%-80%，液体培养，第二天换液。当细胞密度达到80%-90%即可进行传代培养。

1.2.3 建立幽门螺杆菌感染AGS细胞模型：收集对数生长期的AGS细胞接种于6孔培养板中，按1 ×10⁶个细胞/孔，每孔加1ml培养液。用PH7. 2的PBS 收集平板上的幽门螺杆菌，稀释菌液浓度至1 ×10⁹CFU /ml。按照25:1、50:1、100:1、200:1的感染复数 (MOI，细菌数: 细胞数)加入幽门螺杆菌菌液到AGS细胞中，混合培养 0、3、6、12、24 h 后用庆大霉素杀死胞外的细菌，分别收集上清及细胞备用。同时设立了阴性对照和阳性对照( 100ng / ml LPS 处理) 。

1. 2. 4 用ELISA法分别检测幽门螺杆菌与AGS细胞共同培养的上清中的IL-1β、IL-18含量：按照ELISA试剂盒说明书流程进行实验操作。

1. 3 统计学处理：组内采用独立样本t检验，组间均数比较采用方差分析。

2 结果

2. 1 成功培养、鉴定幽门螺杆菌（图1），成功复苏AGS细胞贴壁生长（图2）

2.2不同MOI的幽门螺杆菌刺激AGS细胞相同的12 h，产生的IL-1β和IL-18与菌体数量呈正相关。当MOI为 100:1时细胞因子的产生达最大值，故后续试验统一选用MOI为100:1。相比阴性对照(正常AGS细胞)，幽门螺杆菌刺激能显著增加IL-1β和IL-18的含量，且IL-1β在作用24 h时达到最高产量， IL-18在作用12h时达到最高产量（图3）。

图3 幽门螺杆菌诱导 AGS细胞产生IL-1β和IL-18

Fig.3 幽门螺杆菌 induced production of IL-1βand IL-18 in AGS cells

Note: Compared with untreated control cells，* . P＜0. 01

3 讨论

幽门螺杆菌感染机体后，可引起强烈的体液和细胞免疫应答， 但长期的进化使得幽门螺杆菌在自然感染该菌后可形成后形成有效耐受，因此机体的免疫应答并不能有效清除细菌，反而使多种细胞因子升高，从而造成更严重的炎性反应病理损伤，如IL-1β、IL-6 和 TNF-α等的表达高于幽门螺杆菌阴性者。研究表明，IL-1β具广泛的生物学作用^［3］，是诱导数百个基因的多效多功能细胞因子，IL-1β的过量产生与感染、风湿病、炎症性肠病、自身炎症性疾病有关。IL-18的结构与IL-1β相似，可以由活化的免疫细胞、树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等产生，具有多种免疫调节功能,能够促进T淋巴细胞的增殖和免疫应答过程，它能激活P13K/AKT与NF-κB信号通路，通过多种途径刺激机体产生免疫介导反应和炎症性损伤。IL-1β和IL-18能够增加其他细胞因子如IL-6和TNF-α等的表达，促进炎性细胞的渗出。

NLRP3炎性小体作为炎症反应的核心成分，能够调控固有免疫反应，识别多种病原微生物、内外源性危险信号，刺激炎性细胞活化，促进炎性因子IL-1β和IL-18的成熟释放，参与疾病的进程，如介导肺炎链球菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌等感染所致的炎症过程；介导尿酸盐结晶所致的痛风；介导2型糖尿病的发生发展等[7-10]。H. pylori感染是慢性胃炎的主要病因，而炎症因子与感染性疾病紧密相连。作为H. pylori感染树突状细胞中IL-1β产生的重要调节剂，通过Il-1β信号调节H. pylori在小鼠胃内的定值。本次研究结果显示幽门螺杆菌能够激活AGS细胞，并且其IL-1β和IL-18数量与作用时间和剂量呈正相关，从而介导幽门螺杆菌对宿主的炎症感染，但其如何触发炎症反应以及该过程是否涉及多种激活途径的协同作用尚待深入研究。本实验为深入了解幽门螺杆菌感染，胃炎发生的免疫致病机制提供了新的思路和实验基础，但是幽门螺杆菌否还通过其他炎性小体（如NLRP1、AIM2、NLRC4炎性小体等）通路介导这一感染过程，需要后期进一步的实验证明。

参考文献:

[1] Vania Camilo, Toshiro Sugiyama, Eliette Touati. Pathogenesis of Helicobacter Pylori Infection. Helicobacter. 2017 Sep;22 Suppl 1. doi: 10.1111/hel.12405.

[2] Ieni A，Barresi V，Rigoli L，Fedele F，Tuccari G，Caruso RA. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter Pylori Gastritis: A Brief Review. Int J Mol Sci. 2016 Jan 15;17(1):109.

[3] Hong JB, Zuo W, Wang AJ, Lu NH. Helicobacter pylori Infection Synergistic with IL-1β Gene Polymorphisms Potentially Contributes to the Carcinogenesis of Gastric Cancer. Int J Med Sci. 2016 Apr 8;13(4):298-303.

叶翠莲，博士，讲师，研究方向：病原微生物，生物制药，E-Mail：yecuilian@hotmail.com。该课题受重庆市科技局自然科学基金项目资助，项目编号为cstc2016jcyjA0471。

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