某规模化猪场保育猪猪伪狂犬检测及其原因分析

某规模化猪场保育猪猪伪狂犬检测及其原因分析

龙红娟 梁水弟

吴川市黄坡农业农村服务中心 广东吴川 524500

摘要：本文通过gB-Elisa和gE-Elisa的方法对某规模化养猪场保育猪的血样进行抽样检测，分析保育猪伪狂犬的抗体水平及野毒感染率。同时结合该厂的既往史、免疫状况及不同年龄段猪的临床表现进行综合分析，得出该厂保育猪伪狂犬疾病的具体情况，并且分析原因提出针对性的建议，从而逐步控制与净化该厂的猪伪狂犬疾病。

关键词:伪狂犬；检测；净化

1 材料与方法

1.1 材料

器材：兽用采血器,各微量移液器(Eppendorf),盖板膜，恒温培养箱，酶标仪。

试剂：PRVgE-ELISA抗体检测诊断试剂（IDEXX）试剂盒：包括PRV抗原包被板、阳性对照-稀释的抗PRV gpI猪血清（叠氮钠保存）、阴性对照-对PRV gpI无反应的猪血清（叠氮钠保存）、酶标抗体-抗PRV gpI（辣根过氧化物酶标记，庆大霉素和卡松保存）、TMB底物液、样品稀释液（叠氮钠保存）、10倍浓缩洗涤液（庆大霉素保存）和终止液。

PRV gB-Elisa抗体检测诊断试剂（IDEXX）试剂盒：阳性对照-稀释的抗PRV gB猪血清（叠氮钠保存）、阴性对照-对PRV gB无反应的猪血清（叠氮钠保存）、其他同上。

样品：保育猪3个单元，33个圈舍，每个圈舍随机采取30个样品总计990个血样。

1.2 方法

gB-Elisa的检测，使用IDEXX PRV gB抗体检测试剂盒进行阻断ELISA抗体检测。第一，血样处理：用兽用采血器通过颈静脉采血约5ml，4℃保存送达实验室，进行离心处理（3000r/min离心5分钟），用移液器吸取2mL血清于EP管中，每个EP管都进行标记放于-20℃冰箱保存；第二，血清处理：取出血清，待其融化，将990个待测血清、阳性对照血清、阴性对照血清用样品稀释液进行1：1稀释。样品在吸取前应混匀，吸取每个样本前都要更换新的枪头，每个样品应做相应的标记防止混淆；第三，加样：在第一、二孔分别加入稀释好的阳性对照血清100uL，在第三、四孔分别加入稀释好的阴性对照血清100uL，其余孔分别加入待检血清100uL；第四，温育：加好样后，盖上盖膜板，至37℃温箱中温育30min；第五，洗板：甩去孔内液体，用洗涤液注满反应板孔，无需静置，直接甩出，洗涤3次，最后一次洗涤后拍干板内液体；第六，加酶：每孔加酶标记抗体100 μL；第七，温育：将加好酶标记抗体的反应板盖上盖板膜，置37℃温育30分钟；第八，洗板：甩去孔内液体，用洗涤液注满反应板孔，无需静置，直接甩出，洗涤3次，最后一次洗涤后拍干板内液体；第九，显色：每孔加显色剂100 μL ，震荡混匀， 37 ℃避光反应10分钟；第十：终止：每孔加终止液50 μL ，震荡10秒，充分混匀，终止后即读数；最后，读数：以650nm波长检测，读取各孔吸光度值（OD值）。

gE-Elisa的检测，使用IDEXX PRV gE抗体检测试剂盒进行阻断ELISA抗体检测。第一，加样：取上述处理后的血清，在第一、二孔分别加入稀释好的阳性对照血清100uL，在第三、四孔分别加入稀释好的阴性对照血清100uL，其余孔分别加入待检血清100uL；第二，温育：加好样后，盖上盖膜板，至37℃温箱中温育30min；第三，洗板：甩去孔内液体，用洗涤液注满反应板孔，无需静置，直接甩出，洗涤3次，最后一次洗涤后拍干板内液体；第四，加酶：每孔加酶标记抗体100 μL；第五，温育：将加好酶标记抗体的反应板盖上盖板膜，置37℃温育30分钟；第六，洗板：甩去孔内液体，用洗涤液注满反应板孔，无需静置，直接甩出，洗涤3次，最后一次洗涤后拍干板内液体；第七，显色：每孔加显色剂100μL，震荡混匀，37 ℃避光反应10分钟；第八，终止：每孔加终止液50μL，震荡10秒，充分混匀，终止后即读数；第九，读数：以650nm波长检测，读取各孔吸光度值（OD值）。

1.3 结果测定

实验有效性前提：阴性对照平均值（NCx）减去阳性对照平均值（PCx）应该大于0.3，若实验结果不成立，有可能是实验操作失误造成，应按操作说明进行重复实验。

计算公式：阴性对照平均值（NCx）=2阴性对照孔OD650之和/2；阳性对照平均值（PCx）=2阳性对照孔OD650之和/2；样品与阴性对照的比率（S/N）=血清样品OD650值 /阴性对照平均值（NCx）。

判定标准：若S/N> 0.7，则结果呈阴性；若0.6，则为可疑样品，应重新检测；若S/N≤0.6，则结果呈阳性。

2 结果与分析

2.1 发病保育猪症状及病变

发病保育猪精神不振，另外解剖病死猪肺部、肾脏、腹股沟淋巴结有出血情况，同时病死猪跗关节存在积液，神经症状的猪脑部充血和出血，心脏呈现“绒毛心”。

2.2 猪伪狂犬病疫苗抗体检测结果

通过对三个猪舍保育猪伪狂犬gB抗体检测，得到结果大致如下。其中保育猪舍一，270头，阳性率88.42%，可疑率6.67%，阴性率4.81%；保育猪舍二，360头，阳性率91.11%，可疑率4.17%，阴性率4.72%；保育猪舍三，360头，阳性率87.50%，可疑率5.83%，阴性率6.67%；

2.3 猪伪狂犬病野毒抗体检测结果

通过对三个猪舍保育猪伪狂犬gE抗体检测，得到结果大致如下。其中保育猪舍一，270头，阳性率32.96%，可疑率16.30%，阴性率50.74%（%；保育猪舍二，360头，阳性率31.39%，可疑率15.00%，阴性率53.61%；保育猪舍三，360头，阳性率40.56%，可疑率20.28%，阴性率39.17%。

2.4 分析

从对三个猪舍保育猪伪狂犬gB抗体检测结果可以看出保育三个猪舍共990个血样，其中gB抗体阳性猪共882头，阴性猪共54头，可疑猪共54头，三个猪舍的gB抗体阳性率都较高。从对三个猪舍保育猪伪狂犬gE抗体检测结果可以看出保育一舍和二舍有接近1/3的猪存在gE抗体阳性，保育三舍的gE抗体阳性率甚至超过了40%，排除可疑猪，野毒感染为阴性的猪群的比例只有50%左右，由此可以看出该猪场伪狂犬野毒感染比率较高。因野毒感染率高，所以对三个猪舍保育猪伪狂犬gB抗体检测结果所呈现出的gB抗体率高则不能完全代表伪狂犬疫苗抗体，导致gB抗体的血清学调查失去了临床意义。该厂仔猪出生第一天即打伪狂犬疫苗，但保育猪仍存在大量的野毒感染，推测可能是如下几点原因：第一，该猪场不引进种猪，自己的保育猪充当后备母猪，挑选之后也未进行血清学检测，导致后备母猪中存在伪狂犬的隐性感染，通过垂直传播传染给初生仔猪，尽管仔猪出生第一天就免疫伪狂犬但仍存在野毒感染，由于初生仔猪母源抗体水平较高，所以并未出现明显的临床症状。第二，经过调查，该猪场存在严重的繁殖与呼吸综合征病毒（蓝耳病）的感染，导致猪群出现免疫抑制疾病，对伪狂犬疫苗无法做出有效的免疫应答。第三，该猪场虽然采取多点式饲养，但并未采取全进全出的管理方式，挑选后备猪时只是在种猪群里选择健硕的猪，并未做深一步血清学检测。第四，伪狂犬能感染多种动物，其中老鼠是本病重要的传染源之一，该猪场产房中存在大量的老鼠，妊娠母猪和初生仔猪可能因此感染。第五，该猪场由于厂房面积限制，弱猪和健康猪群并隔离饲养，且饲养密度较大，增加了感染的风险。第六，该猪场采取一日龄滴鼻免疫伪狂犬疫苗措施、此时仔猪母源抗体较高，可能对疫苗产生了免疫干扰。

3 讨论

3.1 净化的难题

第一，与伪狂犬病毒本身有很大的关系，伪狂犬病毒表现为多宿主性，有高度的细胞致病性、复制周期短、常在神经节内形成潜伏感染。所以猪一旦感染该病，伪狂犬病毒就会定植于三叉神经节，造成猪终身带毒，并且不定期排毒。

第二，自2011年起，新型的由伪狂犬病毒的毒株变异引起的伪狂犬病在我国爆发，对于新出现的伪狂犬病毒变异毒株的入侵，传统的疫苗已经不能提供有效的保护了。

第三，我国养猪饲养大环境较差，大部分猪群都存在多种病原混合感染的情况，尤其是近几年来蓝耳病的持续存在导致猪免疫力下降，仔猪流行性腹泻爆发后多数猪场采取反饲的措施使得伪狂犬病又得以盛行。

第四，我国养猪从业人员技术水平较低，饲养管理水平不到位，导致猪群易得病，多发病，增加了伪狂犬的感染几率。

第五，大部分小规模化猪场，在选择和引进后备猪并不做血清学的检测，导致后备猪群中存在野毒隐性感染猪，使得伪狂犬疾病得以传播。

3.2 建议

（1）预防措施

第一，饲养模式。仍然坚持自繁自养的养猪模式，避免从场外引进种猪。若要引进猪群，禁止从疫区引进猪群，引种后先将猪群隔离一至两周，务必做好血清学检测，保证gE抗体阴性后才可入群。

第二，预防免疫。做好免疫预防工作，首先调查该厂伪狂犬流行的毒株，针对流行毒株选择合适的gE基因缺失疫苗，务必保证疫苗的质量并制定合适的免疫程序，务必每一头猪每一次免疫都到位，并做好相关的记录工作。

第三，猪场管理。加强从业人员和猪群的管理工作，提高从业人员的业务水平。该厂未做好封场工作，从业人员可随意进出猪场，应该加强猪场的隔离措施，防止场外疾病传播进场。对于猪群应采取全进全出的饲养方式，应将健康猪群和弱猪群隔离饲养。

第四，生物安全。伪狂犬拥有多宿主性，其中老鼠是其重要的传染源之一，猪场应定期做好捕鼠灭鼠工作。可将老鼠药放置猪群不易触碰到的地方，或者进行人工捕鼠工作。

第五，消毒防腐。加强消毒防腐工作，饲养人员、外来人员都应穿戴工作服经消毒后方可进入猪舍；进入猪场的外来车辆必须经过消毒；对猪栏，漏粪地板，水池、食槽都应定期消毒处理。病死猪应在特定的区域进行剖检，并进行无害化处理。

第六，加强保健。根据不同猪营养需求的特点，供给适当的全价日粮，保证猪群每日所需的营养，可以防止营养性疾病的发生，同时可以增强猪群的体格和抗病能力。饲料应放在通风干燥处，防止发生霉变，饲料中应按照相关的规定合理添加饲料添加剂，同时定期做好驱虫工作，保证猪只正常生长发育，强健体质，增强抗病力。

（2） 净化方案

第一，预防接种。首先应调查该厂流行的是伪狂犬哪一种毒株，针对流行毒株选取合适的gE基因缺失疫苗。不可乱选疫苗，否则由于免疫压力易导致流行毒株发生变异。选取疫苗后应根据合理的免疫程序进行逐头免疫，以防错免漏免。

第二，血清检测。采取gE-Elisa的检测方法，对全部猪只进行血清学检测，扑杀淘汰gE抗体阳性的猪群。再进行持续性伪狂犬疫苗免疫和gE-Elisa血清学检测，再次淘汰阳性猪。

第三，建立无感染猪群。经过两次检测，淘汰全部阳性猪后，全面禁止疫苗的使用，并定期做好猪群的血清学检测，建立伪狂犬无感染的阶段。一个猪场做到伪狂犬净化并不难，难的是全国猪场都需要做净化，仅仅依靠少数猪场净化，国内养猪大环境不改变，结果会给已净化的猪场带来更大的防控压力。所以猪场也应常备伪狂犬gE基因缺失苗，若再次受到伪狂犬病毒的威胁，应该及时预防免疫，避免野毒感染。

参考文献

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